C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/02 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01)
Patent
CA 2526985
Methods and reagents for isolating polynucleotide molecules from uncultured microbial cells in an environmental sample, the method comprising: obtaining uncultured microbial cells from the sample, dispersing the cells from each other and from other components in the sample, purifying the dispersed cells via discontinuous gradient centrifugation wherein the cells are collected in an interface of the gradient, embedding the cells in agarose gel, to produce agarose gel blocks containing the cells, and lysing the cells within the agarose gel blocks, thereby releasing high molecular weight polynucleotide molecules from the cells. Also disclosed are methods and compositions for cloning the polynucleotide molecules so isolated, further comprising incubating the gel blocks with at least a suitable restriction endonuclease to partially digest the polynucleotide molecules, separating the digested polynucleotide molecules by pulse field electrophoresis, to recover fragments of polynucleotide molecules with size of at least 50 kb, ligating recovered fragments of polynucleotide molecules to a suitable cloning vector, and transforming a suitable host cell with the cloning vector containing the fragments of the high molecular weight polynucleotide molecules.
L'invention concerne des procédés et des réactifs respectivement mis en oeuvre et utilisés pour isoler des molécules de polynucléotide à partir de cellules microbiennes non mises en culture dans un échantillon prélevé dans l'environnement. Un tel procédé comprend les étapes consistant à: obtenir des cellules microbiennes non mises en culture à partir de l'échantillon; séparer lesdites cellules l'une de l'autre et d'autres composants se trouvant dans l'échantillon; purifier les cellules séparées par centrifugation à gradient discontinu, lesdites cellules étant collectées dans une interface du gradient; incorporation des cellules dans un gel d'agarose pour l'obtention de blocs de gel d'agarose contenant les cellules; et provocation de la lyse des cellules se trouvant dans les blocs de gel d'agarose pour la libération desdites cellules de molécules de polynucléotides de poids moléculaire élevé. L'invention concerne également des procédés et des compositions permettant de cloner les molécules de polynucléotides ainsi isolées, ces procédés comprenant en outre l'incubation des blocs de gel avec au moins une endonucléase de restriction appropriée, cela pour provoquer la digestion partielle des molécules de polynucléotides, la séparation des molécules de polynucléotides digérées par électrophorèse en champ pulsé, séparation qui permet de récupérer les fragments de molécules de polynucléotides d'une taille d'au moins 50 kb, la ligature des fragments récupérés de molécules de polynucléotides à un vecteur de clonage approprié, et la transformation d'une cellule hôte appropriée avec le vecteur de clonage contenant les fragments des molécules de polynucléotides de poids moléculaire élevé.
Goodman Robert M.
Handelsman Jo E.
Liles Mark R.
Williamson Lynn L.
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Wisconsin Alumni Research Foundation
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1354362