Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use

C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q

Patent

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C12Q 1/68 (2006.01) C07H 19/10 (2006.01) C07H 19/20 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)

Patent

CA 2457754

The present invention describes methods of detecting a nucleic acid in a sample, based on the use of terminal-phosphate-labeled nucleotides as substrates for nucleic acid polymerases. The methods provided by this invention utilize a nucleoside polyphosphate, dideoxynucleoside polyphosphate, or deoxynucleoside polyphosphate analogue which has a colorimetric dye, chemiluminescent, or fluorescent moiety, a mass tag or an electrochemical tag attached to the terminal-phosphate. When a nucleic acid polymerase uses this analogue as a substrate, an enzyme-activatable label would be present on the inorganic polyphosphate by-product of phosphoryl transfer. Cleavage of the polyphosphate product of phosphoryl transfer via phosphatase leads to a detectable change in the label attached thereon. When the polymerase assay is performed in the presence of a phosphatase, there is provided a convenient method for real-time monitoring of DNA or RNA synthesis and detection of a target nucleic acid.

La présente invention concerne des méthodes de détection d'un acide nucléique dans un échantillon, basées sur l'utilisation de nucléotides marqués sur le phosphate de terminaison en tant que substrats de polymérases d'acide nucléique. On utilise dans les méthodes de l'invention un analogue de polyphosphate de nucléoside, de polyphosphate de didéoxynucléoside ou de polyphosphate de déoxynucléoside présentant un fragment colorimétrique, chimiluminescent ou fluorescent, un marqueur de masse ou un marqueur électrochimique rattachés au phosphate de terminaison. Lorsqu'une polymérase d'acide nucléique utilise cet analogue en tant que substrat, un marqueur activable par une enzyme est présent sur le produit dérivé de polyphosphate inorganique du transfert de phosphoryle. Le clivage du produit de polyphosphate de transfert de phosphorylevia la phosphatase génère un changement pouvant être détecté dans le marqueur rattaché. L'invention concerne également une méthode de surveillance en temps réel de la synthèse d'ADN ou d'ARN et de détection d'un acide nucléique cible, utilisée lorsque l'analyse de la polymérase s'effectue en présence d'une phosphatase.

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