C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/12 (2006.01) C07K 14/05 (2006.01) C07K 14/74 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01)
Patent
CA 2270160
The promoter of the EPCR gene has been isolated from both murine (SEQ. ID No. 1) and human (SEQ. ID No. 2) genomic libraries. The promoter has been demonstrated to include a region which results in selective expression in endothelial cells, between -1 and -220 based on the positions relative to the ATG encoding the first amino acid of the murine EPCR protein (nucleotides 3130 to 3350 of SEQ. ID No. 1), and a region which selectively results in expresion in large vessel endothelial cells, as opposed to all endothelial cells, located between -700 and -1080 (nucleotides 2270 to 2840 of SEQ. ID No. 1). A thrombin responsive element has been identified in the EPCR promoter, from - 337 to -345 in the murine promoter (nucleotides 3007 to 3014 SEQ. ID No. 1) and from -360 to -368 (nucleotides 2722 to 2729 SEQ. ID No. 2) in the human promoter. The sequence is CCCACCCC (SEQ. ID No. 3). A serum response element has also been identified between -280 and -350 (nucleotides 2990 to 3061 of SEQ. ID No. 1). The regulatory sequences present in the EPCR promoter can be used in combination with genes encoding other proteins, as well as shorter oligonucleotides, to increase expression by exposure to thrombin or serum or to effect selective expression in endothelial cells generally or preferentially in endothelial cells of the large blood vessels. The gene control elements include elements responsive to environmental stiumuli (either thrombin or serum); and information to determine distribution of the desired protein expression (large vessels). Therapeutic strategies include the use of the minimal promoter (-220 to -1) for expression in all endothelial cells, for example, for any kind of gene therapy where systemic distribution is desired; the use of a promoter including an environmental stimuli response element(s), for use in delivery of agents whose expression should be increased during times of increased thrombin/platelet activation or during regional trauma; the use of the minimal promoter including an environmental stimuli response element and the element directing expression to large vessel endothelium, where a response to regional trauma is desirable but only in large vessel endothelium, and the use of the minimal promoter and element directing expression to large vessel endothelium, where expresion is specifically targeted to large vessel endothelium but is not increased in response to any particular stimuli.
Le promoteur du gène EPCR (récepteur de protéines C de cellules endothéliales) a été isolé à la fois à partir de bibliothèques génomiques murines (numéro d'identification de séquence 1) et humaines (numéro d'identification de séquence 2). Il a été démontré que ce promoteur contient une région qui produit une expression sélective dans les cellules endothéliales, entre les positions -1 à -220 sur la base des positions par rapport à l'ATG codant le premier acide aminé de la protéine EPCR murine (nucléotides 3130 à 3350 de la séquence numéro d'identification 1), ainsi qu'une région qui produit sélectivement une expression dans des cellules endothéliales de gros vaisseaux, en opposition à toutes les cellules endothéliales, situées aux positions -700 à -1080 (nucléotides 2270 à 2840 de la séquence numéro d'identification 1). Un élément réagissant à la thrombine a été identifié dans le promoteur EPCR, aux positions -337 à -345 dans le promoteur murin (nucléotides 3007 à 3014 de la séquence numéro d'identification 1) et en position -360 à -368 (nucléotides 2722 à 2729 de la séquence numéro d'identification 2) dans le promoteur humain. Cette séquence est CCCACCCC (séquence numéro d'identification 3). Un élément réagissant au sérum a été identifié aux positions -280 à -350 (nucléotides 2990 à 3061 de la séquence numéro d'identification 1). On peut utiliser les séquences régulatrices présentes dans le promoteur EPCR en association avec des gènes codant d'autres protéines, ainsi que les oligonucléotides plus courts, pour accroître l'expression par exposition à la trombine ou au sérum ou pour obtenir une expression sélective dans des cellules endothéliales, généralement ou de préférence dans des cellules endothéliales de gros vaisseaux sanguins. Les éléments régulateurs de gènes contiennent des éléments réagissant à des stimuli du milieu ambiant (soit la trombine soit le sérum); ainsi que des informations pour déterminer la répartition de l'expression protéique désirée (dans les gros vaisseaux). Parmi les stratégies thérapeutiques, on trouve l'utilisation du promoteur minimal (-220 à -1) pour produire l'expression dans toutes les cellules endothéliales, par exemple pour tout type de thérapie génique dans laquelle une répartition systémique est désirée, l'utilisation d'un promoteur contenant un ou plusieurs éléments réagissant à des stimuli du milieu ambiant, déstinés à servir à l'administration d'agents dont l'expression doit être augmentée pendant les périodes d'activation de thrombine/plaquettes accrue ou lors d'un traumatisme local; l'utilisation du promoteur minimal contenant un élément réagissant à des stimuli du milieu ambiant ainsi que l'élément dirigeant l'expression vers l'endothélium de gros vaisseaux, où une réponse à un trauma local est désirable mais uniquement dans l'endothélium de gros vaisseaux, ainsi que l'utilisation du promoteur minimal et de l'élément dirigeant l'expression vers l'endothélium de gros vaisseaux, où l'expression est spécifiquement ciblée sur l'endothélium de gros vaisseaux mais n'est pas accrue en réponse à un stimulus particulier.
Esmon Charles T.
Gu Jian-Ming
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Oklahoma Medical Research Foundation
LandOfFree
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