C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01)
Patent
CA 2372131
The invention provides methods and materials for generating a reference library of restriction fragments from pooled nucleic acids that contain a sequence polymorphism. Preferably, such a library is formed by digesting genomic DNA from a pool of individuals with a first and a second restriction endonuclease to form a population of restriction fragments; isolating restriction fragments of the population digested by both the first and second restriction endonucleases and forming a first single stranded fragment population therefrom; separately isolating restriction fragments from the population digested by the first restriction endonuclease but not the second restriction endonuclease and forming a second single stranded fragment population therefrom; hybridizing the first and second single stranded fragment populations to form a population of duplexes; and isolating the population of duplexes to form a reference library of restriction fragments that contain sequence polymorphism. An important aspect of the invention is the use of the reference population of restriction fragments to compare the frequencies of polymorphic sequences between different population pools. Such comparisons may be accomplished by competively hybridizing DNA from the respective pools which has been enriched for the presence of a restriction site polymorphism with DNA from the reference population. Preferably, such competitive hybridization reactions are carried out the reference library attached to one or more solid phase supports. Most preferably, members of the reference library are attached to individual microparticles so that each microparticle has a unique fragment attached. After competitive hybridization, the microparticles may be analyzed and sorted for identifying those microparticles carrying sequences for which the pools being compared exhibit different polymorphic frequencies.
L'invention concerne des méthodes et des matières permettant de créer une banque de référence de fragments de restriction à partir d'un mélange d'acides nucléiques contenant un polymorphisme de séquence. De préférence, la méthode de création de la banque consiste: à faire digérer l'ADN génomique provenant d'un mélange d'individus avec une première et une deuxième endonucléase de restriction afin de former une population de fragments de restriction; à isoler les fragments de restriction de la population digérée par la première et par la deuxième endonucléase de restriction puis à former une première population de fragments monocaténaires; à séparer les fragments de restriction de la population digérée par la première endonucléase de restriction mais non par la deuxième endonucléase de restriction puis à former une deuxième population de fragments monocaténaires; à hybrider les première et deuxième populations de fragments monocaténaires pour former une population de duplex; puis à isoler la population de duplex pour créer une banque de référence de fragments de restriction contenant un polymorphisme de séquence. Dans un aspect important, l'invention concerne l'utilisation de la population de référence de fragments de restriction pour comparer les fréquences de séquences polymorphes entre différents mélanges de populations. On peut établir ces comparaisons en effectuant une hybridation compétitive de l'ADN provenant des mélanges respectifs et enrichi par la présence d'un polymorphisme de site de restriction avec l'ADN provenant de la population de référence. De préférence, ces réactions d'hybridation compétitive sont réalisées par la banque de référence reliée à un ou plusieurs supports en phase solide. Idéalement, les éléments de la banque de référence sont liés à des microparticules individuelles de sorte qu'à chaque microparticule est lié un fragment unique. Après l'hybridation compétitive, on peut analyser et trier les microparticules afin d'identifier les microparticules comportant des séquences pour lesquelles les mélanges comparés présentent différentes fréquences polymorphes.
Gowling Lafleur Henderson Llp
Lynx Therapeutics Inc.
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