C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2359272
Method of obtaining a library of tags able to define a specific state of a biological sample, comprising the following successive steps: (1) extracting in a single-step mRNA from a small amount of a biological sample using oligo(dT)25 covalently bound to paramagnetic beads, (2) generating a double strand cDNA library, from said mRNA, (3) cleaving the obtained cDNAs using Sau3A I, (4) separating the cleaved cDNAs in two aliquots, (5) ligating the cDNA contained in each of said two aliquots via said Sau3A I restriction site to a linker consisting of one double-strand cDNA molecule having one of the following formulas: GATCGTCCC-X1 or GATCGTCCC-X2, wherein X1 and X2, which comprise 30-37 nucleotides and are different, include a 20-25 bp PCR priming site with a Tm of 55~C-65~C, (6) digesting the products obtained in step (5) with the tagging enzyme BsmF I, (7) blunt-ending said BsmF I tags with a DNA polymerase and mixing the tags ligated with the different linkers, (8) ligating the tags obtained in step (7) to form ditags with a DNA ligase, (9) amplifying the ditags obtained in step (8) with primers comprising 20-25 bp and having a Tm of 55~-65~C, (10) isolating the ditags having between 20 and 28 bp from the amplification products obtained in step (9) by digesting said amplification products with Sau3A I and separating the digested products, (11) ligating the ditags obtained in step (10) to form concatemers, purifiying said concatemers and separating the concatemers having more than 300 bp, (12) cloning and sequencing said concatemers and (13) analysing the different obtained tags.
La présente invention concerne des procédés donnant une échantillothèque d'étiquettes capables de définir un état spécifique d'un échantillon biologique. Ce procédé comporte la suite suivante d'opérations. (1) Extraction en une seule opération de l'ARNm d'une petite quantité d'un échantillon biologique en utilisant un oligo(dT)¿25? lié par colavence à des billes paramagnétiques. (2) Génération, à partir de l'ARNm, d'une échantillothèque d'ADNc à double brin. (3) Clivage, par Sau3A I, des ADNc obtenus. (4) Séparation des ADNc en deux parties aliquotes. (5) Ligation, sur un lieur, de l'ADNc contenu dans chacune de ces deux parties aliquotes, via le site de restriction de ces parties aliquotes, lequel lieur est constitué d'une molécule d'ADNc à double brin comprenant l'une des deux formes GATCGTCCC-X¿1? et GATCGTCCC-X¿2?, formes dans lesquelles X¿1? et X¿2?, qui comprennent 30 à 37 nucléotides et qui sont différents, incluent un site d'amorce de PCR à 20-25 bp avec une Tm de 55·C-65·C. (6) Digestion, avec l'enzyme d'étiquetage BsmF I, des produits résultant de (5). (7) Utilisation d'une polymérase d'ADN de façon à fournir aux étiquettes BsmF I des extrémités franches, et mélange des étiquettes présentant des ligations avec les différents lieurs. (8) Ligation des étiquettes issues de (7) de façon à former des di-étiquettes avec une ligase d'ADN. (9) Utilisation d'amorces pour amplifier les di-étiquettes de (8), lesquelles amorces comprennent 20-25 bp et présente une Tm de 55·-65·C. (10) Digestion des di-étiquettes entre 20 et 28 bp pour les séparer des aux produits d'amplification issus de (9), laquelle digestion des produits d'amplification se fait avec Sau3A I et séparation des produits digérés. (11) Ligation des di-étiquettes de (10) donnant des concatémères, puis purification de ces concatémères et séparation des concatémères de plus de 300 bp. (12) Clonage et séquençage de ces concatémères et (13) analyse des différentes étiquettes obtenues.
Cheval Lydie
Elalouf Jean-Marc
Virlon Berangere
No associations
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