C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2450580
A method is described for determining telomere length of mammalian chromosomal DNA, which method comprises the steps: (a) annealing the 3' end of a single- stranded oligonucleotide (hereinafter referred to as a 'telorette') to a single-stranded overhang of the telomere comprising the G-rich telomere strand (comprising TTAGGG repeat sequences) and covalently binding the telorette to the 5' end of the C-rich telomeric strand (having CCCTAA repeat sequences) thereby forming a ligation product; (b) amplifying the ligation product formed in step (a) to form a primer extension product; and (c) detecting the length of the primer extension product(s) of step (b). Step (b) is preferably carried out by PCR using: (i) a first primer capable of annealing to a telomere- adjacent region of DNA but which first primer is not capable of annealing to the C-rich telomeric repeat sequence (CCCTAA); and (ii) a second primer (hereinafter referred to as a 'teltail' primer) identical to the 5' end sequence of the telorette of step (a) which amplification is effected under conditions such that the first primer hybridises to the C-rich telomeric strand (comprising the CCCTAA repeats) and is extended to form a first primer extension product; and the teltail primer hybridises to the first primer extension product and is extended to form a second primer extension product. Also described are specific primers, including telorettes and teltails, for carrying out the method; a kit for use in the method; and the use of the method in determining telomere length and assessing biological conditions associated therewith.
L'invention concerne un procédé permettant de déterminer la longueur des télomères de l'ADN chromosomique des mammifères. Les étapes de ce procédé consistent: (a) à hybrider l'extrémité 3' d'un oligonucléotide simple brin (appelée 'télorette' ci-après) avec un prolongement simple brin du télomère comprenant le brin télomérique riche en G (comprenant des séquences répétitives TTAGGG) et à lier de manière covalente cette <= télorette >= avec l'extrémité 5' du brin télomérique riche en C (comprenant des séquences répétitives CCCTAA) de manière à former un produit de ligation; (b) à amplifier le produit de ligation formé à l'étape (a) afin de former un produit d'extension de l'amorce ; et (c) à détecter la longueur du produit ou des produits d'extension de l'amorce obtenus à l'étape (b). L'étape (b) est de préférence réalisée au moyen d'une amplification par PCR pour laquelle on utilise: (i) une première amorce capable de s'hybrider avec une région d'ADN adjacente au télomère, cette première amorce n'étant toutefois pas capable de s'hybrider avec la séquence télomérique répétitive riche en C (CCCTAA); et (ii) une seconde amorce (appelée amorce "téloqueue") identique à la séquence de l'extrémité 5' de la <= télorette >= de l'étape (a) dont l'amplification est réalisée dans des conditions provoquant l'hybridation de la première amorce avec le brin télomérique riche en C (comprenant les séquences répétitive CCCTAA) et l'amplification de cette amorce, formant ainsi un premier produit d'extension de l'amorce, puis l'hybridation de l'amorce <= téloqueue >= avec ce premier produit d'extension de l'amorce et son amplification, de manière à former un second produit d'extension d'amorce. L'invention concerne également des amorces spécifiques, comprenant des <= télorettes >= et des <= téloqueues >= permettant la mise en oeuvre de ce procédé, une trousse de matériel destinée à ce procédé et l'utilisation de ce procédé pour la détermination de la longueur des télomères et l'évaluation des conditions biologiques associées à celle-ci..
Smart & Biggar
University College Cardiff Consultants Limited
University Of Wales College Of Medicine
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1560222