C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01)
Patent
CA 2496813
The disclosure describes a method for isolating genes encoding proteins that regulate the expression of target genes of interest, said method designated herein for convenience by the term: "Cre-Trap cloning." In brief, the Cre-trap cloning method of the invention involves modifying a target gene of interest such that it encodes the Cre recombinase and Herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase (TK) proteins. This step is followed by mutagenesis and selection for cells which have lost target gene expression by virtue of their resistance to ganciclovir (a nucleoside analog structurally related to acyclovir), which kills cells expressing HSV TK. Cell lines that have lost target gene expression due to mutations in genes encoding traps-acting factors are then transiently transfected with a cDNA library from the parent cell line in a novel expression vector (pCT.l, shown in Figure 1). Expression of a cDNA that complements the genetic mutation results in expression of the target gene and production of the Cre recombinase, which modifies pCT.I in such a way that it is readily isolated from pCT.I plasmids with cDNAs that do not activate target gene expression.
La présente invention concerne une méthode d'isolement de gènes codant pour des protéines qui régulent l'expression de gènes cibles à étudier, ladite méthode étant ici désignée pour des raisons de commodité par le terme de: "clonage Cre-Trap". En bref, la méthode de clonage Cre-Trap selon l'invention consiste à modifier un gène cible à étudier de sorte qu'il code pour la recombinase Cre et les protéines de thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès simplex (HSV). Ladite étape est suivie de la mutagenèse et de la sélection de cellules qui n'expriment plus le gène cible en raison de leur résistance au ganciclovir (un analogue nucléosidique associé sur le plan structural à l'acyclovir), lequel tue les cellules exprimant la HSV TK. Des lignées cellulaires qui n'expriment plus le gène cible du fait de mutations au niveau de gènes codant pour des facteurs trans-activateurs sont ensuite transitoirement transfectées avec une bibliothèque d'ADNc de lignée cellulaire mère présente dans un vecteur d'expression nouveau (pCT.1, Figure 1). L'expression d'un ADNc complétant la mutation génétique entraîne l'expression du gène cible et la production de la recombinase Cre, ce qui modifie le pCT.1 d'une telle manière qu'il est rapidement isolé de plasmides de pCT.1 présentant des ADNc qui n'activent pas l'expression du gène cible.
Sleckman Barry P.
Smart & Biggar
Washington University
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1597053