C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2314225
Ligase-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) methods are used to detect target double-stranded nucleic acid fragments such as those generated during the process of apoptosis. In these methods, a detectable oligonucleotide is incorporated into the target. This detectable oligonucleotide contains the donor moiety and/or the acceptor moiety of a molecular energy transfer (MET) pair. An example of a MET pair is a fluorescence energy resonance transfer (FRET) pair consisting of a fluorophore (donor) moiety and a quencher (acceptor) moiety. The donor moiety of the MET pair emits detectable energy such as light only when the detectable oligonucleotide is incorporated into the target. In these methods, a linker-primer oligonucleotide annealed to a ligation-aid oligonucleotide, or a linker-primer oligonucleotide containing a ligation-aid sequence, is ligated to the 5' end of each strand of a double- stranded nucleic acid fragment containing either a blunt end or a terminal overhang. After this ligation step, a detectable oligonucleotide capable of annealing to the complement of the linker-primer oligonucleotide is incorporated into the target by polymerase-catalyzed reactions. Alternatively, the linker-primer oligonucleotide is also a detectable oligonucleotide. Optionally, the target labeled by the detectable oligonucleotide is subsequently amplified, wherein the detectable oligonucleotide is incorporated into the amplification product. The target is detected by detecting the energy emitted by the donor moiety of the detectable oligonucleotide.
L'invention concerne des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase induite par ligase (LM-PCR) utilisées pour détecter des fragments cibles d'acides nucléiques à double brin tels que ceux qui sont générés lors du processus apoptosique. Selon ces méthodes, un oligonucléotide détectable est incorporé dans la cible. Cet oligonucléotide détectable renferme la fraction donneur et/ou la fraction receveur d'une paire de transfert d'énergie moléculaire (MET). Un exemple de paire MET est une paire de transfert par résonance d'énergie de fluorescence (FRET) constituée d'une fraction fluorophore (donneur) et d'une fraction extinctrice de luminescence (receveur). La fraction donneur de la paire MET émet de l'énergie détectable telle que de la lumière seulement lorsque l'oligonucléotide détectable est incorporé dans la cible. Selon ces méthodes, un oligonucléotide lieur-amorce est attaché à un oligonucléotide d'aide à la liaison, ou un oligonucléotide lieur-amorce renfermant une séquence d'aide à la liaison est lié à l'extrémité 5' de chacun des brins d'un fragment d'acides nucléiques à double brin renfermant soit une extrémité franche soit un surplomb terminal. Après cette étape de liaison, un oligonucléotide détectable capable d'être attaché au complément de l'oligonuléotide lieur-amorce est incorporé dans la cible par réactions catalysées par polymérase. Selon un autre mode de réalisation, l'oligonucléotide lieur-amorce est également un oligonucléotide détectable. Eventuellement, la cible marquée par l'oligonucléotide détectable est ensuite amplifiée, l'oligonucléotide détectable étant incorporé au produit d'amplification. La cible est détectée par détection de l'énergie émise par le groupe donneur de l'oligonucléotide détectable.
James William M.
Nazarenko Irina A.
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
Intergen Company
James William M.
Nazarenko Irina A.
LandOfFree
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