Luciferase labelling method

Details Luciferase labelling method Luciferase labelling method

C - Chemistry, Metallurgy

12

N

C12N 9/96 (2006.01) C12Q 1/66 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/535 (2006.01) G01N 33/543 (2006.01)

Patent

CA 2198470

A method is provided for conjugating luciferase to a chemical entity, particularly to a specific binding agent such as m antibody, antigen or a nucleic acid, and more particularly an antibody, comprising (a) mixing the luciferase with one or more of D-luciferin, magnesium ions and adenosine triphosphate and (b) performing a covalent coupling reaction between the luciferase and the binding reagent using a covalent coupling reagent wherein the amount of D-luciferin, magnesium ions and/or adenosine triphosphate is sufficient to protect the luciferase activity against inhibition by the covalent coupling reagent. Preferably the step (a) is carried out by mixing the luciferase with its substrates in solution and preferably both magnesium and adenosine triphosphate are present as magnesium adenosine triphosphate (Mg2+ATP), optionally together with D-luciferin. In a second aspect of the invention there is provided a labelled chemical entity comprising a chemical entity conjugated to active luciferase as provided by the method of the present invention. Preferably the chemical entity is a specific binding agent suitable for use in a specific binding assay, preferably being an antibody, antigen or nucleic acid. When the binding agent is a nucleic acid, it is preferably an oligonucleotide, but may be a polynucleotide or a nucleoside, and may be used as a hybridisation probe or a chain extension primer e.g. a PCR primer. Most advantageously the entity is an antibody as previous attempts to couple antibodies to luciferase have resulted in inactivity. Test kits are further provided.

L'invention concerne un procédé de conjugaison de la luciférase à une entité chimique, notamment à un agent de liaison spécifique tel qu'un anticorps, un antigène ou un acide nucléique et, tout particulièrement, un anticorps, consistant (a) à mélanger la luciférase avec un ou plusieurs D-luciférine, ions magnésium et adénosine triphosphate, et (b) à provoquer une réaction de couplage covalent entre la luciférase et le réactif de liaison en faisant appel à un réactif de couplage covalent où la quantité de D-luciférine, d'ions magnésium et/ou d'adénosine triphosphate soit suffisante pour protéger l'activité de la luciférase de l'inhibition par le réactif de couplage covalent. Il es préférable d'exécuter les opérations de l'étape (a) en mélangeant la luciférase avec ses substrats en solution et que tant le magnésium que l'adénosine triphosphate soient présents sous la forme de magnésium-adénosine-triphosphate (Mg<2+>ATP), éventuellement avec de la D-luciférine. Le second aspect de l'invention se rapporte à une entité chimique marquée comprenant une entité chimique conjuguée à de la luciférase active comme présenté ci-dessus. Il est préférable que l'entité chimique soit un agent de liaison spécifique se prêtant à un titrage par liaison spécifique et qu'il s'agisse de préférence d'un anticorps, d'un antigène ou d'acide nucléique. Lorsque l'agent de liaison est un acide nucléique, il est préférable qu'il soit un oligonucléotide, mais il peut s'agir d'un polynucléotide ou d'un nucléoside, et il peut être utilisé comme sonde d'hybridation ou amorce d'allongement de la chaîne, par exemple, une amorce de PCR. Il est des plus profitable que cette entité soit un anticorops dans la mesure où les précédentes tentatives pour coupler des anticorps à la luciférase se sont soldées par une inactivité. L'invention a également trait à des matériels de test.

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