C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/12 (2006.01) C07K 14/82 (2006.01) C07K 16/32 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) C12N 15/90 (2006.01) C12Q 1/04 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/574 (2006.01)
Patent
CA 2236168
Methods are provided for identifying a gene at a random chromosomal locus in the genome of a mammalian cell. The method involves inactivating one copy of the gene by integrating one DNA construct (knockout construct) in that gene copy. The knockout construct includes a positive selection marker region sequence and, in a 5' direction from the selection marker region sequence, a transcription initiation region sequence responsive to a transactivation factor, said transcription initiation region oriented for antisense RNA transcription in the direction away from the selection marker region sequence. The second copy of the gene is inactivated by transforming the cells with a second DNA construct (transactivation construct) containing a gene sequence for the transactivation factor which initiates antisense RNA transcription extending from the knockout construct into the chromosomal locus flanking the knockout construct at its 5' end. Inactivation of both gene copies may result in a change in cell phenotype distinguishable from the wild-type phenotype. Optionally, the wild-type phenotype can be regained by introducing a third construct that can inhibit antisense RNA transcription. A gene is provided associated with tumor susceptibility of mammalian cells, tsg 101.
L'invention concerne des procédés pour identifier un gène au niveau d'un locus chromosomique aléatoire dans le génome d'une cellule mammifère. L'un de ces procédés consiste à inactiver une copie du gène par intégration d'un produit de recombinaison d'ADN (produit de recombinaison par élimination) dans cette copie du gène. Ce produit de recombinaison par élimination comprend une séquence de régions marqueurs de sélection positive et, dans une direction 5' partant de cette séquence, une séquence de régions d'initiation de transcription en réaction à un facteur de transactivation, ladite région d'initiation de transcription étant orientée, en vue d'une transcription d'ARN antisens, dans la direction opposée à la séquence de régions marqueurs de sélection. La deuxième copie du gène est inactivée par transformation des cellules avec un deuxième produit de recombinaison d'ADN (produit de recombinaison par transactivation) contenant une séquence génique destinée au facteur de transactivation qui initie la transcription d'ARN antisens s'étendant du produit de recombinaison par élimination jusque dans le locus chromosomique adjacent au produit de recombinaison par élimination, au niveau de son extrémité 5'. L'inactivation des deux copies de gène peut entraîner une modification du phénotype cellulaire pouvant être distingué du phénotype de type sauvage. Eventuellement, ce dernier peut être récupéré par introduction d'un troisième produit de recombinaison en mesure d'inhiber la transcription d'ARN antisens. L'invention décrit par ailleurs un gène associé à la prédisposition tumorale des cellules mammifères, le tsg 101.
Cohen Stanley N.
Li Limin
Ridout & Maybee Llp
The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University
LandOfFree
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