Intracellular generation of single-stranded dna

Details Intracellular generation of single-stranded dna Intracellular generation of single-stranded dna

C - Chemistry, Metallurgy

12

N

C12N 15/85 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/90 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)

Patent

CA 2470033

Methods for intracellularly generating single stranded DNA molecules that are active in mediating triplex-dependent or independent chromosomal events are provided herein. The method is based on the discovery that one can introduce viral vectors or plasmids into the cells, where they generate within the cells to be engineered the single stranded DNA molecules that bind to the target chromosomal DNA to form a triplex, which may induce a desired mutation, and/or be recombinagenic and induce a change to the chromosomal DNA by incorporation of a donor DNA molecule. The vectors or plasmid not only encode the TFO and optionally the donor DNA, but also a reverse transcriptase, and optionally, a restriction enzyme, which is present in the preferred embodiment as a fusion protein which reverse transcribes the RNA encoded by the vector or plasmid, then cleaves it at a restriction enzyme site to yield a single stranded DNA. The single stranded DNA may be produced directly, or initially as a double stranded stem-single stranded loop structure, which is then cleaved to yield the single stranded DNA.

L'invention concerne des méthodes de génération intracellulaire de molécules d'ADN monocaténaire, médiatrices actives d'événements chromosomiques dépendants ou indépendants du triplex. La méthode est fondée sur la découverte selon laquelle des vecteurs ou plasmides viraux peuvent être introduits dans des cellules à manipuler génétiquement, à l'intérieur desquelles ils produisent lesdites molécules d'ADN monocaténaire qui se lient à l'ADN chromosomique cible pour former un triplex capable d'induire une mutation désirée; et/ou peuvent être recombinagènes et induire une modification de l'ADN chromosomique par incorporation d'une molécule d'ADN donneuse. Les vecteurs ou plasmides codent non seulement les TFO, et éventuellement l'ADN donneuse, mais aussi une transcriptase inverse et éventuellement une enzyme de restriction, décrite dans le mode de réalisation préféré comme une protéine hybride qui effectue une transcription inverse de l'ARN codé par le vecteur ou le plasmide, puis le clive au niveau d'un site de l'enzyme de restriction pour produire un ADN monocaténaire. L'ADN monocaténaire peut être produit directement, ou à l'origine comme une structure en tige bicaténaire et boucle monocaténaire qui est ensuite clivée pour produire ledit ADN monocaténaire.

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