C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C40B 30/04 (2006.01)
Patent
CA 2366374
The present invention relates to a method for determining the genotypes of polymorphic loci amplified in a mixture of restriction fragments, using an oligonucleotide sequence that is essentially complementary to part of the target restriction fragment, and located adjacent (upstream) to the polymorphism to be detected, said method comprising the steps of: a) contacting the mixture of restriction fragments with the oligonucleotide sequence under hybridization conditions, such that when the target restriction fragment is present, a hybrid is formed between the target restriction fragment and the oligonucleotide sequence, such that resulting hybrid has at least one unpaired nucleotide of the target restriction fragment directly adjacent to the 3' end of the oligonucleotide sequence; b) adding at least one labeled nucleotide or nucleotide analog to the mixture resulting from step a), under conditions suit-able for extension of an oligonucleotide; such that when a hybrid of the target restriction fragment and the oligonucleotide is present, and said at least one labeled nucleotide or nucleotide analog is complementary to the at least one unpaired nucleotide of said target restriction fragment directly adjacent to the 3' end of the oligonucleotide sequence, the nucleotide sequence is extended with the labeled nucleotide or nucleotide analog; c) detecting the presence or absence of any hybrid(s) with (an) added labeled nucleotide(s) or nucleotide analog(s), and/or of any oligonucleotide sequence with (an) added labeled nucleotide(s) or nucleotide analog(s). The method of the invention can in particular be used for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) in (constant) AFLP-fragments.
La présente invention se rapporte à une méthode de détermination des génotypes de loci polymorphiques amplifiés dans un mélange de fragments de restriction, à l'aide d'une séquence oligonucléotidique qui est essentiellement complémentaire d'une partie du fragment de restriction, et située en position adjacente (amont) au polymorphisme à détecter. Ladite méthode consiste (a) à mettre en contact le mélange de fragments de restriction avec la séquence oligonucléotidique dans des conditions d'hybridation, de sorte que lorsque le fragment de restriction cible est présent, un hybride est formé entre le fragment de restriction cible et la séquence oligonucléotidique, de sorte que l'hybride résultant possède au moins un nucléotide non apparié du fragment de restriction cible directement adjacent à l'extrémité 3' de la séquence oligonucléotidique; (b) à ajouter au moins un nucléotide ou un analogue de nucléotide étiqueté au mélange issu de l'étape (a), dans des conditions permettant l'extension d'un oligonucléotide, de sorte que lorsqu'un hybride du fragment de restriction cible et de l'oligonucléotide est présent, et que ledit nucléotide ou analogue de nucléotide étiqueté est complémentaire dudit nucléotide non apparié du fragment de restriction cible directement adjacent à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique, la séquence nucléotidique est allongée avec le nucléotide ou l'analogue de nucléotide étiqueté; (c) à détecter la présence ou l'absence de tout(tous les) hybride(s) avec un (plusieurs) nucléotide(s) ou analogue(s) de nucléotide(s) étiqueté(s) ajouté(s), et/ou de toute séquence oligonucléotidique avec un (plusieurs) nucléotide(s) ou analogue(s) de nucléotide(s) étiqueté(s) ajouté(s). La méthode de cette invention peut notamment servir à détecter des polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP single nucleotide polymorphisms) dans des fragments AFLP (constants).
Kuiper Marius Tiemen Roelof
Witsenboer Hanneke
Keygene N.v.
Mccarthy Tetrault Llp
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-2023033