C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01)
Patent
CA 2685133
In this study, pork-specific real-time PCR assay is developed for Halal authentication. Three species of meat samples are employed, which were pork, beef and chicken. These three type of poultry meat are among the commonly consumed meat in Malaysia and are easily available in the market. DNA from each raw meat sample was successfully extracted using DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen,Hilden,Germany). Concentration of DNA extracted is estimated by UV absorption spectrophotometry using the Biophotometer (Eppendorf AG,Hamburg,Germany) prior to real-time PCR reaction. The annealing temperature for the primers is at 58°C. To verify the specificity of primers designed, reaction is carried out to test the primers against the other two meat samples to detect possible cross-reactions. The reaction only amplified pork DNA at Ct~22.83. The real-time PC assay described in this paper proved to be very sensitive with a low detection limit when samples were tested. The assay is done by preparing a 10- fold dilution series starting from 100 ng DNA were used to determine the sensitivity of the reaction. The sensitivity threshold was up to 0.001 ng pork DNA. It has been reported that a detection limit of 0.1 ng pork DNA using conventional PCR. In this context, the method would be useful in the detection of porcine DNA in food products.
Selon l'invention, une analyse PCR en temps réel spécifique au porc a été mise au point en vue d'une authentification Halal. Trois espèces d'échantillons de viande ont été utilisées : du porc, du boef et du poulet. Ces trois types de viande figurent parmi les plus couramment consommés en Malaisie et se trouvent facilement sur le marché. De l'ADN de chaque échantillon de viande crue a été extrait avec succès au moyen du kit DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Allemagne). La concentration d'ADN extrait a été estimée par spectrophotométrie d'absorption dans l'ultraviolet au moyen d'un biophotomètre (Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne), avant la réaction PCR en temps réel. La température d'hybridation des amorces était de 580 °C. Afin de vérifier la spécificité des amorces élaborées, une réaction visant à tester les amorces par rapport aux deux autres échantillons de viande a été réalisée afin de détecter de possibles réactions croisées. La réaction n'a amplifié que l'ADN de porc à ± 22,83 Ct. L'analyse PCR en temps réel décrite dans la description s'est révélée très sensible, avec une limite de détection basse lors du test des échantillons. Ladite analyse a été effectuée en préparant des gammes de dilution de raison 10 à partir de 100 ng d'ADN, afin de déterminer la sensibilité de la réaction. Le seuil de sensibilité allait jusqu'à 0,001 ng d'ADN de porc. Il a été constaté que la limite de détection se situait à 0,1 ng d'ADN de porc au moyen de la PCR conventionnelle. Dans ce contexte, ce procédé serait utile dans la détection d'ADN porcin présent dans des produits alimentaires.
Abdul Rahim Raha
Azmi Aida Azrina
B. Che Man Yaakob
Khalid Farihah Liyana
Mustafa Shuhaimi
Fasken Martineau Dumoulin Llp
Universiti Putra Malaysia
LandOfFree
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