C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2485506
A method for in vitro molecular evolution of protein function The invention provides a method for generating a polynucleotide sequence or population of sequences from parent single-stranded polynucleotide sequences encoding one or more protein motifs, comprising the steps of (a) providing a first population of single-stranded polynucleotide molecules and a second population of single- stranded polynucleotide molecules, the first and second populations together constituting plus and minus strands of parent polynucleotide sequences, (b) carrying out a reaction for digesting the first and second populations of single-stranded polynucleotide molecules with an exonuclease to generate corresponding populations of single-stranded polynucleotide fragments, (c) contacting said fragments generated from the plus strands with fragments generated from the minus strands and optionally, adding primer sequences that anneal to the 3'and 5'ends of at least one of the parent polynucleotides under annealing conditions, and (d) amplifying the fragments that anneal to each other to generate at least one polynucleotide sequence encoding one or more protein motifs having altered characteristics as compared to the one or more protein motifs encoded by said parent polynucleotides, wherein, in step (b), at least one parameter of the reaction used for digestion of the first population of single-stranded polynucleotide molecules is different from the equivalent parameter(s) used in the reaction for digestion of the second population of single-stranded polynucleotide molecules. Preferably, the reaction parameter is selected from exonuclease type, exonuclease concentration, reaction volume, duration of the digestion reaction, temperature of the reaction mixture, pH of the reaction mixture, length of parent single~-stranded polynucleotide sequences, amount of single-stranded polynucleotide molecules and buffer composition of the reaction mixture.
L'invention concerne une méthode pour générer une séquence polynucléotidique ou une population de séquences polynucléotidiques à simple brin apparentées codant un ou plusieurs motifs de protéine. Cette méthode comprend les opérations suivantes : (a) préparer une première population de séquences polynucléotidiques à simple brin et une deuxième population de séquences polynucléotidiques à simple brin, ces deux populations constituant ensemble des brins positifs et négatifs de séquences polynucléotidiques apparentées, (b) réaliser une réaction de digestion comprenant la première et la deuxième population de molécules polynucléotidiques à simple brin et une exonucléase pour générer des populations correspondantes de fragments polynucléotidiques à simple brin, (c) mettre en contact ces fragments générés à partir des brins positifs avec des fragments générés à partir des brins négatifs et ajouter éventuellement des séquences amorces qui créent un annelage aux extrémités 3' et 5'd'au moins un des polynucléotides apparentés dans des conditions d'annelage, et (d) amplifier les fragments qui s'hybrident mutuellement pour générer au moins une séquence polynucléotidique codant un ou plusieurs motifs de protéine dont les caractéristiques sont altérées comparativement au(x) motif(s) de protéine codé(s) par lesdits polynucléotides apparentés. Dans l'étape (b), au moins un paramètre de la réaction appliquée pour la digestion de la première population de molécules polynucléotidiques à simple brin diffère du/des paramètre(s) équivalent(s) utilisé(s) dans la réaction de digestion de la deuxième population de molécules polynucléotidiques à simple brin. Le paramètre de la réaction est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant le type d'exonucléase, la concentration d'exonucléase, le volume de la réaction, la durée de la digestion, la température du mélange réactionnel, le pH du mélange réactionnel, la longueur des séquences polynucléotidiques à simple brin apparentées, la quantité des molécules polynucléotidiques à simple brin et la composition tampon du mélange réactionnel.
Borrebaeck Carl Arne Krister
Carlsson Roland
Furebring Christina
Hager Ann-Christin Malmborg
Alligator Bioscience Ab
Borden Ladner Gervais Llp
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1687634