C - Chemistry – Metallurgy – 07 – K
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
K
C07K 1/04 (2006.01) A61K 38/08 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01)
Patent
CA 2307805
This invention provides for the active site mapping of enzymes which catalyse covalent modification including, but not limited to phosphorylation, acylation, dephosphorylation in which a fixed residue (known as the catalytic residue) such as a tyrosine, serine, threonine, histidine, aspartic acid residue or any other residue containing an appropriate side chain is modified. Mapping of protein kinases is exemplified. The method of the invention has an additional level of complexity over and above that of the self-deconvoluting libraries described in WO97/42216. This involves making a library of smaller libraries (referred to as subsets) where a fixed residue is moved stepwise through the sequence of amino acids or other groups (such as peptidomimetics). Using 5 subsets of libraries of peptides of 5 amino acids allows the mapping of a sequence of 9 amino acids. In general one could carry out the invention using n subsets of n-mer peptides so as to provide mapping data for the residues from -(n-1) to +(n-1) either side of the active site. Thus in general the length of the mapped sequence would be (2n)-1. In this invention there is no need to separate modified from unmodified sequences because of the self deconvoluting nature of the library. The assay screen produces a series of hits, the patterns of which reveal the unique sequences in each well. This enables a pattern of substrate preferences to be determined for any enzyme. The unique sequences obtained using this invention can be used to provide substrates for high throughput assays and provide detailed information about the active site to aid rational drug design. This invention can also be used as an inhibitor library to screen against known modifying enzymes where a known substrate exists and can be set up in an assay format.
L'invention a trait à l'établissement d'un relevé topologique des sites actifs d'enzymes qui catalysent une modification covalente comprenant, mais non limitée à une phosphorylation, une acylation et une déphosphorylation dans lesquelles est modifié un résidu fixe (connu sous le nom de résidu catalytique) tel qu'un résidu de tyrosine, de sérine, de thréonine, d'histidine, d'acide aspartique ou tout autre résidu contenant une chaîne latérale appropriée. Le relevé topologique de protéine kinases est donné en exemple. Le procédé de l'invention comporte un niveau supplémentaire de complexité qui surpasse celui de banques à auto-déconvolution décrites dans WO97/42216. Cela implique la formation d'une banque constituée de banques plus petites (appelées sous-ensembles) dans lesquelles un résidu fixe est déplacé par étapes à travers la séquence d'acides aminés ou d'autres groupes (tels que des peptidomimétiques). A l'aide de 5 sous-ensembles de banques de peptides de 5 acides aminés, on obtient le relevé topographique d'une séquence de 9 acides aminés. En général, on peut mettre en oeuvre le procédé à l'aide de n sous-ensembles de peptides n-mères de manière à produire des données topographiques pour les résidus situés entre -(n-1) et +(n-1) de chaque côté du site actif. Ainsi, en général, la longueur de la séquence faisant l'objet du relevé topographique est de (2n)-1. Dans cette invention, il n'est pas nécessaire de séparer des séquences modifiées de séquences non modifiées en raison de la nature d'auto-déconvolution de la banque. Le criblage d'échantillons produit une série d'occurrences dont les motifs révèlent les séquences uniques dans chaque puits. Cela permet de déterminer un motif de des préférences de substrat pour toute enzyme. Les séquences uniques obtenues au moyen de l'invention peuvent être utilisées pour produire des substrats utiles pour des titrages de haut rendement, et fournir des informations détaillées concernant le site actif afin de contribuer à une conception rationnelle de médicaments. L'invention peut également être utilisée comme banque d'inhibiteurs à tester contre des enzymes modificatrices connues pour lesquelles un substrat connu existe et peut être organisé selon un format de titrage.
Clark Jonathan
Lamont Alan
Williams David
Fetherstonhaugh & Co.
Medivir Uk Ltd
Peptide Therapeutics Limited
LandOfFree
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