.alpha.2,8/2,9 polysialyltransferase

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C - Chemistry, Metallurgy

12

P

C12P 19/24 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12N 9/10 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) C12P 19/18 (2006.01)

Patent

CA 2339173

The capsular polysaccharide of Escherichia coli K92 contains alternating (-8- NeuAc.alpha.2-) and (-9-NeuAc.alpha.2-) linkages. The enzyme catalyzing this polymerizing reaction has been cloned from the genomic DNA of E. coli K92. The 1.2 kb PCR1 fragment was subcloned in pRSET vector and the protein was expressed in the BL21(DE3) strain of E. coli with a hexameric histidine at its N-terminal end. The enzyme was isolated in the supernatant after lysis of the cells and fractionated by ultracentrifugation. Western blotting using anti- histidine antibody showed the presence of a band that migrated at about 47.5 kD on both reducing and non-reducing SDS-PAGE, indicating a monomeric enzyme. Among the carbohydrate acceptors tested, N-acetylneuraminic acid and the gangliosides GD3 and GQ1b were preferred substrates. The cell-free enzyme reaction products obtained were characterized by NMR and mass spectrometry, which indicated the presence of both .alpha.2,9- and .alpha.2,8-linked polysialyl structure. The K92 neuS gene was used to transform the K1 strain of E. coli, the capsule of which contains only (-8-NeuAc.alpha.2-) linkages. Analysis of the polysaccharides isolated from these transformed cells is consistent with the presence of both (-8-NeuAc.alpha.2-) and (-9-NeuAc.alpha.2- ) linkages. It is disclosed that the neuS gene product of E. coli K92 catalyzes the synthesis of polysialic acid with .alpha.2,9- and .alpha.2,8- linkages in vitro and in vivo.

Le polysaccharide capsulaire d'Escherichia coli K92 contient des liaisons alternées(-8-NeuAc.alpha.2-) et (-9-NeuAc.alpha.2-). L'enzyme catalysant cette réaction de polymérisation a été cloné à partir de l'ADN génomique de E-coli K92. Le fragment ACP?1¿ de 1,2 kb a été sous-cloné dans le vecteur pRSET et la protéine a été exprimée dans la souche BL21 (DE3) de E. coli avec une histidine hexamère au niveau de son extrémité N-terminale. L'enzyme a été isolé dans le surnageant après lyse des cellules, puis fractionné par ultracentrifugation. Un transfert de type Western utilisant un anticorps anti-histidine a démontré la présence d'une bande ayant migré à environ 47,5 kD sur SDS-PAGE à la fois réducteur et non réducteur, indiquant un enzyme monomère. Parmi les accepteurs de glucide testés, l'acide N-acétylneuraminique et les gangliosides GD¿3? et GQ¿1b? ont constitués des substrats préférés. Les produits de réaction enzymatique sans cellules obtenus ont été caractérisés par RMN et spectrométrie de masse, ayant indiqué la présence d'une structure polysialyle à liaison à la fois .alpha.2,9- et .alpha.2,8. Le gène neuS K92 a été utilisé pour transformer la souche K1 de E. coli, dont la capsule ne contient que des liaisons (-8-NeuAc.alpha.2-). L'analyse des polysaccharides isolés à partir de ces cellules transformées concorde avec la présence de liaisons à la fois (-8-NeuAc.alpha.2-) et (9-NeuAc.alpha.2-). Il est décrit que le produit génique NeuS de E. coli K92 catalyse la synthèse de l'acide polysialique avec des liaisons .alpha.2,9- et .alpha.2,8- in vitro et in vivo.

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