C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/00 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12P 1/00 (2006.01) C12Q 1/32 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
Patent
CA 2377573
The present invention describes a rapid and efficient <i>in vivo</i> library- <i>versus</i>-library screening strategy for identifying optimally interacting pairs of heterodimerizing polypeptides. It allows for the screening of a protein library against a second protein library, rather than against a single bait protein, and thus has numerous applications in the study of protein- protein interactions. Additionally, it allows for the application of different selection stringencies. Two leucine zipper libraries, semi-randomized at the positions adjacent to the hydrophobic core, were genetically fused to either one of two designed fragments of the enzyme murine dihydrofolate reductase (mDHFR), and cotransformed into <i>E. coli.</i> Interaction between the library polypeptides was required for reconstitution of the enzymatic activity of mDHFR, allowing bacterial growth. Analysis of the resulting colonies revealed important biases in the zipper sequences relative to the original libraries, which are consistent with selection for stable, heterodimerizing pairs. Using more weakly associating mDHFR fragments, we increased the stringency of selection. We enriched the best performing leucine zipper pairs by multiple passaging of the pooled, selected colonies in liquid culture, as the best pairs allowed for better bacterial propagation. This competitive growth allowed small differences among the pairs to be amplified, and different sequence positions were enriched at different rates. We applied these selection processes to a library-<i>versus</i>-library sample of 2.0 x 106 combinations, and selected a novel leucine zipper pair which may be appropriate for use in further <i>in vivo</i> heterodimerization strategies.
La présente invention concerne un processus de criblage rapide et efficace <i>in vivo</i> bibliothèque contre bibliothèque, permettant d'identifier de manière optimale des paires de polypeptides d'hétérodimisation en interaction. Cette invention permet le criblage d'une bibliothèque de protéines contre une seconde bibliothèque de protéines, plutôt que contre une seule protéine <= appât >=, elle permet ainsi un grand nombre d'applications dans l'étude des interactions protéine-protéine. De plus, ce processus permet l'application de stringences de sélections diverses. Deux bibliothèques de fermeture de leucine semi-aléatoires se trouvant à des positions adjacentes au noyau hydrophobe ont été génétiquement couplées à l'un des deux fragments désignés de l'enzyme murine dihydrofolate réductase (mDHFR). En outre, l'interaction E.coli cotransformée entre les polypeptides de la bibliothèque était nécessaire pour la reconstitution de l'activité enzymatique de la mDHFR, elle a permis la croissance bactérienne. L'analyse des colonies obtenues a révélé des décalages importants dans les séquences de fermeture par rapport aux bibliothèques d'origine, lesquelles sont compatibles avec une sélection de paires d'hétérodimerisation stables. L'utilisation de fragments de mDHFR à faible association a permis d'augmenter la rigueur de la sélection. Nous avons enrichi les paires de fermeture les plus performantes par passages multiples des colonies regroupées et sélectionnées dans un liquide de culture; les meilleures paires permettant une meilleure propagation bactérienne. Cette croissance avantageuse a permis d'obtenir des différences minimes entre les paires devant être amplifiées. Des positions de séquences différentes ont été enrichies à différentes vitesses. Ces processus de sélection ont été appliqués à un échantillon bibliothèque contre bibliothèque comprenant 2,0 x 10?6¿ combinaisons, et une nouvelle paire de fermeture de leucine pouvant convenir à d'autres processus d'hétérodimérisation in vivo à été sélectionnée.
Arndt Katja M.
Michnick Stephen W.
Pelletier Joelle Nina
Pluckthun Andreas
Odyssey Pharmaceuticals Inc.
Sim & Mcburney
LandOfFree
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