C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2342837
Disclosed are compositions and an in vitro method for cloning and/or amplification of nucleic acid sequences of interest. The method is based on strand displacement replication of the nucleic acid sequences by multiple priming on artificial long terminal repeat (ALTR) sequences appended to the ends of the nucleic acid molecule of interest. The nucleic acid molecules for cloning and amplification can be very long, up to 40 to 80 Kb or longer. In a preferred form of the method, a single primer is used to prime strand displacement replication at multiple sites in artificial long terminal repeat sequences, flanking a target nucleic acid, containing multiple tandem repeats of a primer complement sequence. Amplification proceeds by replication initiated at each primer and continuing through the target nucleic acid sequence. This nested replication of multiple copies significantly increases the amplification yield for extremely long nucleic acid molecules. By using a sufficient number of repeat units in the ALTRs, only a few rounds of replication are required to produce hundreds of thousands of copies of the nucleic acid sequence of interest. A preferred form of the disclosed method makes use of indexed artificial long terminal repeats that allow amplification and identification of specific nucleic acid fragments present in a mixture of nucleic acid fragments without requiring any knowledge of the sequence of the nucleic acid fragment.
L'invention concerne des compositions et une méthode in vitro permettant de cloner et/ou d'amplifier des séquences d'acide nucléique considérées. Cette méthode, basée sur une réplication des séquences d'acide nucléique par déplacement de brins, consiste en un amorçage sur des longs segments terminaux artificiels à répétitions ajoutés aux extrémités de la molécule d'acide nucléique considérée. Les molécules d'acide nucléique destinées au clonage et à l'amplification peuvent être très longues ; elles peuvent mesurer entre 40 et 80 Kb ou plus. Dans un mode de réalisation préféré, une seule amorce est utilisée pour amorcer la réplication par déplacement de brins sur de longs segments terminaux artificiels à répétitions, au niveau de plusieurs sites adjacents à un acide nucléique cible et contenant plusieurs répétitions en tandem d'une séquence complémentaire d'amorce. L'invention concerne également des procédés d'amplification par réplication commençant au niveau de chaque amorce et continuant à travers la séquence d'acide nucléique cible. Cette réplication emboîtée de plusieurs copies permet d'améliorer sensiblement le rendement d'amplification pour des molécules d'acide nucléique très longues. Grâce à l'utilisation d'un nombre suffisant d'unités de répétition sur les longs segments terminaux artificiels à répétitions, seuls quelques séries de réplications sont nécessaires pour produire des centaines de milliers de copies de la séquence d'acide nucléique considérée. De préférence, la méthode fait appel à de longs segments terminaux artificiels à répétitions répertoriés qui permettent l'amplification et l'identification de fragments spécifiques d'acide nucléique présents dans un mélange de fragments sans qu'aucune connaissance de la séquence du fragment d'acide nucléique ne soit nécessaire.
Gowling Lafleur Henderson Llp
Yale University
LandOfFree
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