C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/53 (2006.01) C07K 1/22 (2006.01) C07K 14/38 (2006.01) C07K 16/40 (2006.01) C12N 1/14 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 3/00 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 9/00 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12N 9/04 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) C12P 21/00 (2006.01) C12P 33/10 (2006.01) C12Q 1/26 (2006.01) G01N 33/566 (2006.01)
Patent
CA 2427615
The present invention relates to a novel cytochrome P450-like enzyme (Aspergillus ochraceus) isolated from cDNA library generated from the mRNA of Aspergillus ochraceus spores. When the cDNA encoding the 11 alpha hydroxylase was co-expressed inSpodoptera frugiperda (Sf-9) insect cells with the cDNA encoding human oxidoreductase as an electron donor, it successfully catalyzed the conversion of the steroid substrate 4-androstene-3,17-dione (AD) to 11 alpha-hydroxy-AD as determined by HPLC analysis. The invention also relates to nucleic acid molecules associated with or derived from these cDNAs including complements, homologues and fragments thereof, and methods of using these nucleic acid molecules, to generate, for example, polypeptides and fragments thereof. The invention also relates to the generation of antibodies that recognizes the A. ochraceus 11 alpha hydroxylase and oxidoreductase and methods of using these antibodies to detect the presence of these native and recombinant polypeptides within unmodified and transformed host cells, respectively. The invention also provides methods of expressing the Aspergillus 11 alpha hydroxylase gene separately, or in combination with human or Aspergillusoxidoreductase, in heterologous host cells, to facilitate the bioconversion of steroid substances to their 11 alpha hydroxy-counterparts.
La présente invention concerne une nouvelle enzyme cytochrome de type P450 (11 alpha hydroxylase d'Aspergillus ochraceus) et une oxydoréductase (oxydoréductase d'Aspergillus ochraceus) isolées de la bibliothèque d'ADNc générée de l'ARNm des pores d'Aspergillus ochraceus. Lorsque l'ADNc codant pour la 11 alpha hydroxylase est co-exprimé dans des cellules d'insecte Spodoptera frugiperda (Sf-9) avec l'ADNc codant pour l'oxydoréductase humaine en tant que donneur d'électrons, il catalyse avec succès la conversion de 4-androstène-3,17-dione (AD) à substrat stéroïde en 11 alpha-hydroxy-AD tel que déterminé par l'analyse HPLC. L'invention concerne également des molécules d'acides nucléiques associées à ou dérivées de ces ADNc, y compris des compléments, des homologues et des fragments de ceux-ci, et des méthodes d'utilisation de ces molécules d'acides nucléiques, pour générer, par exemple, des polypeptides et des fragments de ceux-ci. L'invention concerne en outre la génération d'anticorps reconnaissant la 11 alpha hydroxylase et l'oxydoréductase d'A. ochraceus, et des méthodes d'utilisation de ces anticorps afin de détecter la présence de ces polypeptides endogènes et de recombinaison dans des cellules hôtes non modifiées et transformées, respectivement. L'invention concerne également des méthodes d'expression du gène 11 alpha hydroxylase d'Aspergillus séparément ou en combinaison avec l'oxydoréductase humaine ou d'Aspergillus, dans des cellules hôtes hétérologues, afin de faciliter la bioconversion de substances stéroïdes en homologues 11 alpha hydroxy.
Bolten Suzanne
Clayton Robert
Easton Alan
Engel Leslie
Messing Dean
Osler Hoskin & Harcourt Llp
Pharmacia Corporation
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-2019374