C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/37 (2006.01) G01N 33/573 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01)
Patent
CA 2377491
The DegP (HtrA) protease is a multifunctional protein essential for the removal of misfolded and aggregated proteins in the periplasm. The present invention provides an assay for inhibitors of DegP activity, comprising mixing a suspected inhibitor of DegP activity with DegP and a suitable substrate (preferably a native substrate of DegP such as PapA) and detecting changes in DegP activity. DegP has been shown to be essential for virulence in several Gram negative pathogens. Only three natural targets for DegP have been described: colicin A lysis protein (Cal), pilin subunits (K88, K99, Pap) and recently HMW1 and HMW2 from Hemophilus influenzae. In vitro, DegP has shown weak protease activity on casein and several other non-native substrates. The present inventors have identified the major pilin subunit of the Pap pilus, PapA, as a native DegP substrate and demonstrated binding and proteolysis of this substrate in vitro. Using an NH2-terminal affinity tag the present inventors have purified PapA away from the PapD chaperone, in the presence of denaturant, to use as a proteolysis substrate. This finding will allow the identification of the DegP recognition and cleavage sites in substrate proteins, and further, allow the design of small molecule inhibitors of protease function.
La protéase DegP (HtrA) est une protéine multifonctionnelle indispensable pour l'élimination des protéines incorrectement repliées et agrégées dans le périplasme. L'invention concerne une méthode d'identification d'inhibiteurs de l'activité DegP, consistant à mélanger un inhibiteur potentiel de l'activité DegP avec DegP et un substrat adéquat (de préférence un substrat endogène de DegP tel que PapA) et à détecter les modifications de l'activité DegP. Le gène DegP s'est avéré déterminant pour la virulence dans un grand nombre de pathogènes Gram négatifs. Seules trois cibles naturelles de DegP ont été décrites: la protéine de lyse colicine A (cal), des sous-unités piline (K88, K99, Pap) et plus récemment HMW1 et HMW2 de Hemophilus influenzae. In vitro, DegP a montré une faible activité protéasique sur la caséine et sur un grand nombre d'autres substrats non endogènes. Les inventeurs ont identifié la sous-unité piline principale du pilus Pap, PapA, comme étant un substrat endogène de DegP et ont démontré la liaison et la protéolyse de ce substrat in vitro. A l'aide d'un marqueur de l'affinité NH2-terminale les inventeurs ont purifié PapA en le séparant du chaperon PapD, en présence d'un agent dénaturant, afin de l'utiliser en tant que substrat de protéolyse. Cette découverte va permettre l'identification des sites de reconnaissance, et de clivage dans les protéine de substrat ainsi que la mise au point de petites molécules inhibitrices de la fonction protéase.
Evans Amy K.
Franke Christine A.
Hruby Dennis E.
Hultgren Scott J.
Jones Hal C.
Siga Technologies Inc.
Sim & Mcburney
Washington University
LandOfFree
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