Assay for identifying inhibitors of hiv rt dimerization

Details Assay for identifying inhibitors of hiv rt dimerization Assay for identifying inhibitors of hiv rt dimerization

C - Chemistry, Metallurgy

12

Q

C12Q 1/70 (2006.01) C12Q 1/48 (2006.01)

Patent

CA 2450871

A method for measuring heterodimerization of HIV RT, which comprises the steps of:a) providing a first solution comprising p66 subunit homodimers in the presence of a dissociation agent; b) contacting the first solution with p51 RT subunits and incubating in the presence of a reassociation buffer to allow association of a complex of p66/p51 RT subunits, wherein one of the subunits comprises an affinity tag and the other of the subunits comprises a detectable label; c) contacting the incubate of step b) with an affinity medium under conditions that enable the p66/p51 complex to bind to the affinity medium; and d) determining the amount of complex formed by measuring the level of detectable label bound to the affinity medium (or by measuring the reconstituted RT polymerase activity). Steps a) to d) can be carried out in the presence or absence of a test compound followed by e) comparing the test compound sample to a control sample lacking the compound, whereby modulated p66/p51 complex formation in the test compound sample is indicative of the ability of the compound to modulate, inhibit or enhance heterodimerization.The method can be used to screen for inhibitors of HIV RT dimerization.

L'invention concerne un procédé permettant de mesurer l'hétérodimérisation de la TI du VIH. Ce procédé comprend les étapes suivantes : a) on prépare une première solution comprenant des homodimères de la sous-unité p66 en présence d'un agent de dissociation, b) on met en contact cette première solution avec des sous-unités de TI p51, et on incube ce mélange en présence d'un tampon de réassociation afin de permettre la formation d'un complexe des sous-unités TI p66/p51, l'une de ces sous-unités comprenant un marqueur d'affinité et l'autre sous-unité comprenant un marqueur détectable, c) on fait entrer en contact le produit d'incubation obtenu à l'étape b) avec un support d'affinité dans des conditions permettant la liaison du complexe p66/p51 avec le support d'affinité, et d) on détermine la quantité de complexe formé en mesurant le niveau de marqueur détectable lié avec le support d'affinité (ou en mesurant l'activité polymérase de la TI reconstituée). Les étapes a) à d) peuvent être effectuées éventuellement en présence d'un composé d'essai, et sont suivies, le cas échéant, d'une étape e) consistant à comparer l'échantillon de composé d'essai avec un échantillon témoin ne contenant pas ce composé. La formation d'un complexe p66/p51 modulé dans l'échantillon contenant composé d'essai donne une indication de la capacité du composé à moduler, à inhiber ou à stimuler l'hétérodimérisation. Ce procédé peut être utilisé pour un criblage permettant l'identification d'inhibiteurs de la dimérisation de la TI du VIH.

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