Asynchronous primed pcr

Details Asynchronous primed pcr Asynchronous primed pcr

C - Chemistry, Metallurgy

12

Q

C12Q 1/68 (2006.01)

Patent

CA 2412413

An asynchronous thermal cycling protocol for nucleic acid amplification uses two primers with thermal melting temperatures different by about 10 to 30 ~C. After the higher melting primer has annealed and polymerase mediated extension, the uncopied, single-stranded target sequence may be hybridized and detected by a probe. DNA probes may be cleaved by the exonuclease activity of a polymerase. The probe may be a non-cleaving analog such as PNA. When a probe is labelled with a reporter dye and a quencher selected to undergo energy transfer, e.g. FRET, fluorescence from the reporter dye may be effectively quenched when the probe is unbound. Upon hybridization of the probe to complementary target or upon cleavage while bound to target, the reporter dye is no longer quenched, resulting in a detectable amount of fluorescence. The second, lower-melting primer may be annealed and extended to generate a double- stranded nucleic acid. Amplification may be monitored in real time, including each cycle, or at the end point. The asynchronous PCR thermal cycling protocol can generate a preponderance of the PCR amplicon in single-stranded form by repetition at the end of the protocol of annealing and extension of the higher melting primer.

L'invention concerne un protocole de formation de cycle thermique asynchrone pour amplification d'acide nucléique, utilisant deux amorces à des températures de fusion thermique différentes d'environ 10 à 30 ·C. Une fois que l'amorce à fusion la plus élevée a été annelée et qu'une extension a été régulée par la polymérase, la séquence cible simple brin non copiée peut être hybridée et détectée au moyen d'une sonde. Des sondes d'ADN peuvent être clivées par l'activité de l'exonucléase d'une polymérase. La sonde peut être un analogue non clivé tel que PNA. Lorsqu'une sonde est marquée au moyen d'un colorant rapporteur et qu'un agent d'extinction est sélectionné de façon à effectuer un transfert d'énergie, par exemple FRET, la fluorescence provenant dudit colorant rapporteur est efficacement éteinte lorsque la sonde est libre. Lors de l'hybridation de la sonde avec une cible complémentaire ou lors d'un clivage lorsqu'il est lié à une cible, le colorant rapporteur n'est plus éteint, ce qui produit une quantité de fluorescence détectable. La seconde amorce à fusion la plus basse peut être annelée et étendue de façon à produire un acide nucléique double brin. Des amplifications peuvent être surveillées en temps réel, notamment pour chaque cycle ou au niveau du point d'extrémité . Le protocole de formation de cycle thermique asynchrone de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) peut produire une prépondérance de l'amplicon PCR sous une forme simple brin par répétition au niveau de l'extrémité du protocole permettant d'anneler et d'étendre l'amorce à fusion la plus élevée.

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