C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/87 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01)
Patent
CA 2328477
The invention is based on the reaction of recombinagenic oligonucleotides in a cell-free system containing a cytoplasmic cell extract and a test duplex DNA on a plasmid. The reaction specifically converts a mutant kanr gene to recover the resistant phenotype in transformed MutS, RecA deficient bacteria and allows for the rapid and quantitative comparison of recombinagenic oligonucleobases. Using this system a type of Duplex Mutational Vector termed a Heteroduplex Mutational Vector, was shown to be more active than the types of mutational vectors heretofore tested. Further improvements in activity were obtained by replacement of a tetrathymidine linker by a nuclease resistant oligonucleotide, such as tetra-2'-O-methyl-uridine, to link the two strands of the Duplex Mutational Vector and removal of the DNA-containing intervening segment. The claims concern Duplex Mutational Vectors that contain the above improvements. In an alternative embodiment the claims concern a reaction mixture containing a recombinagenic oligonucleobase, a cell-free enzyme mixture and a duplex DNA containing a target sequence. In yet an alternative embodiment, the invention concerns the use of such mixture to test improvements in recombinagenic oligonucleobases, as well as to test the effects of compounds on the activity of the cell-free enzyme mixture and also to make specific changes in the target DNA sequence.
L'invention concerne la réaction d'oligonucléotides de recombinaison dans un système acellulaire renfermant un extrait de cellule cytoplasmique et de l'ADN duplex test sur un plasmide. Spécifiquement, la réaction a pour effet de convertir un gène mutant kan?r¿, ce qui permet de récupérer le phénotype résistant dans des bactéries transformées à déficience de MutS, RecA, et donc d'effectuer une comparaison quantitative et rapide des oligonucléobases de recombinaison. Sur la base d'un tel système, on a montré qu'un vecteur duplex mutationnel appelé vecteur hétéroduplex mutationnel était plus actif dans les cellules considérées que les types de vecteurs mutationnels testés jusqu'à présent. On a encore amélioré l'activité en remplaçant le segment de liaison tétrathymidine par un oligonucléotide résistant à la nucléase, du type tétra-2'-O-méthyl-uridine, de manière à lier les deux brins du vecteur duplex mutationnel. Une autre amélioration a consisté à éliminer le segment intervenant qui contient de l'ADN. L'invention concerne donc des vecteurs hétéroduplex mutationnels présentant les améliorations décrites. Selon un aspect, l'invention concerne un mélange réactionnel à oligonucléobase de recombinaison, un mélange enzymatique acellulaire et de l'ADN duplex renfermant une séquence cible. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation de ce type de mélange pour tester les améliorations relatives aux oligonucléobases de recombinaison, pour tester aussi les effets de composés sur l'activité du mélange enzymatique acellulaire, et pour apporter des modifications spécifiques à la séquence d'ADN cible.
Cole-Strauss Allyson D.
Gamper Howard B.
Kmiec Eric B.
Kimeragen Inc.
Osler Hoskin & Harcourt Llp
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1684006