C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01)
Patent
CA 2264581
A method for characterising cDNA, which comprises: (a) cutting a sample comprising a population of one or more cDNAs or isolated fragments thereof, each having a strand complementary to the 3' poly-A terminus of an mRNA and bearing a tail, with a first sampling endonuclease at a first sampling site of known displacement from a reference site proximal to the tail to generate from each cDNA or isolated fragment thereof a first and second sub-fragment, each comprising a sticky end sequence of predetermined length and unknown sequence, the first sub-fragment bearing the tail; (b) sorting either the first or second sub-fragments into sub-populations according to their sticky end sequence and recording the sticky end sequence of each sub-population as the first sticky end; (c) cutting the sub-fragments in each sub-population with a second sampling endonuclease, which is the same as or different from the first sampling endonuclease, at a second sampling site of known displacement from the first sampling site to generate from each sub-fragment a further sub- fragment comprising a second sticky end sequence of predetermined length and unknown sequence; and (d) determining each second sticky end sequence; wherein the aggregate length of the first and second sticky end sequences of each sub- fragment is from 6 to 10; and wherein the sequences and relative positions of the reference site and first and second sticky ends characterise the or each cDNA.
L'invention porte sur un procédé de caractérisation d'ADNc comportant les étapes suivantes: (a) découpage d'un échantillon comportant une population d'un ou de plusieurs ADNc ou leurs fragments isolés dont chacun possède un brin complémentaire de la terminaison 3' poly-A d'un ARNm et porte une queue présentant une première endonucléase d'échantillonnage en un premier site d'échantillonnage à une distance connue d'un site de référence proche de la queue de manière à produire à partir de chacun des ADNc, ou de leurs fragments isolés, un premier et un deuxième sous-fragment comportant chacun une séquence d'extrémité collante d'une longueur prédéterminée et de séquence inconnue; (b) tri du premier ou du deuxième sous-fragment en sous-populations en fonction de leur séquence d'extrémité collante puis enregistrement desdites séquences de chacune des sous-populations en tant que première extrémité collante; (c) découpage des sous-fragments de chacune des sous-populations à l'aide d'une deuxième endonucléase d'échantillonnage identique ou différente de la première endonucléase d'échantillonnage au niveau d'un deuxième site d'échantillonnage et à une distance connue du premier site d'échantillonnage de manière à ce que chacun des sous-fragments produise un nouveau sous-fragment comportant une deuxième extrémité collante d'une longueur prédéterminée et de séquence inconnue; (d) détermination de chaque séquence de deuxième extrémité collante. La longueur cumulée de la première et de la deuxième extrémité collante de chacun des sous-fragments est comprise entre 6 et 10, et les séquences et les positions relatives des sites de référence latéraux de la première et de la deuxième extrémité collante caractérisent le ou chaque ADNc.
Schmidt Gunter
Thompson Andrew Hugin
Brax Genomics Limited
Ridout & Maybee Llp
Xzillion Gmbh & Co. Kg
LandOfFree
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