C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/64 (2006.01) C12N 15/65 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01)
Patent
CA 2389282
Disclosed are methods for isolating transformed host cells which contain a vector incorporating a nucleic acid insert comprising the steps of: (a) providing a vector which comprises (i) a cytotoxic gene permitting positive selection, (e.g. a methyltrans- ferase such as MspI) arranged such as to be insertionally inactivated by the incorporation of a nucleic acid insert (ii) a gene which provides a host cell transformed with the vector with a protective effect against a selection agent, but which does not degrade the selection agent (e.g. an antibiotic resistance gene such as TetA(c); (b) cloning a nucleic acid insert into the vector; (c) transforming host cells with the vector; (d) selecting transformed host cells in a single homogenous selection step, which step does not include growing the host cells on an agar medium.
Cette invention se rapporte à de nouveaux procédés en une seule étape, sans étalement, servant à isoler des cellules hôtes transformées qui contiennent un vecteur incorporant un segment d'insertion d'acide nucléique. Un tel procédé typique consiste: (a) à former un vecteur qui comprend: (i) un gène permettant une sélection positive, constitué par un gène cytotoxique ( par exemple une méthyltransférase, telle que <i>Msp</i>I) conçu pour être inactivé en mode d'insertion par l'incorporation d'un segment d'insertion d'acide nucléique hétérologue dans ledit vecteur; (ii) un gène qui forme une cellule hôte transformée par ledit vecteur avec un effet de protection contre un agent de sélection, mais que ne dégrade pas notablement l'agent de sélection dans un milieu dans lequel est présent l'hôte (par exemple un gène de résistance aux antibiotiques tel que TetA(c) qui code un produit ne détruisant pas l'agent de sélection mais servant de membrane associée à la pompe d'efflux de l'antibiotique capable d'abaisser la concentration intracellulaire de l'agent de sélection, tout en maintenant pratiquement constante sa concentration intercellulaire); (b) à cloner un segment d'insertion d'acide nucléique hétérologue pour former ledit vecteur; (c) à transformer une population de cellules hôtes à l'aide dudit vecteur; (d) à sélectionner des cellules hôtes transformées par ce vecteur en une seule étape de sélection homogène, qui ne consiste pas à faire croître les cellules hôtes sur un milieu hagar, par exemple en sélectionnant des cellules hôtes transformées par ce vecteur dans un milieu de propagation liquide contenant l'agent de sélection. Cette invention concerne également des procédés correspondant servant à cloner ou à isoler des gènes. Cette invention concerne également des procédés correspondant servant à cloner ou à isoler des gènes. Le segment d'insertion d'acide nucléique hétérologue peut être obtenu par chromatographie de l'acide nucléique, en vue de déterminer au préalable sa taille (par exemple à l'aide du système transgénomique, Inc. WAVE<RTM>). Cette invention concerne également des vecteurs conçus pour être utilisés dans ces procédés (par exemple le vecteur pMTet1 représenté dans la figure 2 et ayant le numéro d'identification de séquence 1), plus des compositions, des kits et des systèmes, ainsi que des procédés et des processus d'utilisation correspondants.
Hornby David Peter Joseph
Matin Maryam Moghaddam
Dennison Associates
Hornby David Peter Joseph
Matin Maryam Moghaddam
Transgenomic Inc.
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-2026007