C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 9/12 (2006.01) C07H 19/04 (2006.01) C07H 19/10 (2006.01) C07H 19/20 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01) C07H 23/00 (2006.01) C12P 19/30 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)
Patent
CA 2197479
A method for the stepwise creation of phosphodiester bonds between desired nucleosides resulting in the synthesis of polynucleotides having a predetermined nucleotide sequence by preparing an initiation substrate containing a free and unmodified 3'-hydroxyl group; attaching a mononucleotide selected according to the order of the predetermined nucleotide sequence to the 3'-hydroxyl of the initiating substrate in a solution containing a catalytic amount of an enzyme capable of catalyzing the 5' to 3' phosphodiester linkage of the 5'-phosphate of the mononucleotide to the 3'- hydroxyl of the initiating substrate, wherein the mononucleotide contains a protected 3'-hydroxyl group, whereby the protected mononucleotide is covalently linked to the initiating substrate and further additions are hindered by the 3'-hydroxyl protecting group. The figure is a diagram of enzymatic synthesis of an oligonucleotide using a template independent polymerase and a nucleoside 5'-triphosphate having a removable blocking moiety at its 3' position. Methods in which a mononucleotide immobilized on a solid support is added to a free polynucleotide chain are also disclosed.
L'invention concerne un procédé permettant la création, par étapes, de liaisons phosphodiester entre des nucléosides désirés résultant de la synthèse de polynucléotides présentant une séquence nucléotidique prédéterminée. Ledit procédé consiste: à préparer un substrat d'initiation contenant un groupe hydroxyle en position 3', libre et non modifié; à fixer un mononucléotide sélectionné selon l'ordre de la séquence nucléotidique prédéterminée au groupe hydroxyle de la position 3' du substrat d'initiation, dans une solution contenant une quantité catalytique d'une enzme pouvant catalyser la liaison phosphodiester de la position 5' à la position 3', c'est-à-dire du phosphate se trouvant en position 5' du mononucléotide au groupe hydroxyle se trouvant en position 3' du substrat d'initiation. Ledit mononucléotide contient un groupe hydroxyle protégé en position 3', et ce mononucléotide protégé est lié par covalence au substrat d'initiation, d'autres additions étant empêchées par le groupe protecteur hydroxyle se trouvant en position 3'. La figure représente un diagramme de la synthèse enzymatique d'un oligonucléotide réalisée au moyen d'une polymérase indépendante de la matrice et d'un triphosphate situé en position 5' d'un nucléoside et comportant une fraction de blocage amovible en position 3'. Sont également décrits des procédés selon lesquels un mononucléotide immobilisé sur un support solide est ajouté à une chaîne polynucléotidique libre.
Hiatt Andrew C.
Rose Floyd
Arkin Gary
Hiatt Andrew C.
Rose Floyd
Rose-Hiatt Biotechnology Partnership
LandOfFree
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