C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01)
Patent
CA 2431898
The present invention provides compositions, methods, and kits for identifying agents that are capable of disrupting protein-protein interaction in a mammalian reverse two-hybrid system. A tetracycline repressor protein was fused with the inhibitory KRAB domain as a suppressor to tightly regulate the reverse two-hybrid system for mammalian cells. Binding of the chimeric protein to the tetracycline operator sequence provided within a promoter entirely suppressed the expression of two interactive proteins. When both an inducer and a candidate protein-protein interaction disrupting agent such as a drug were added in the cell culture together, the reporter gene was either activated by the interaction of protein-pair if the drug was ineffective or remained silent due to the disruption of the protein-protein interaction by the effective drug. The plasmids for the suppressor and the reporter were integrated into chromosomes. Constructs for the expression of interactive proteins were either stably or transiently transfected into the cells. The utility of this system for screening drugs, particularly for enzyme inhibitor drugs, was demonstrated by using two well characterized interactions of the type I receptor for TGF.beta. with FKPB12 and the EGF receptor with p85. The interaction between TGF.beta.RI and FKPB12 or between EGF receptor and p85 were disrupted by FK506 and kinase inhibitor AG1478, respectively. The mammalian reverse two-hybrid system of the present invention can also be used for high throughput screening of compounds that disrupt protein-protein interactions.
L'invention concerne des compositions, des procédés et des kits permettant d'identifier des agents capables de perturber l'interaction protéine-protéine dans un système double-hybride inverse d'un mammifère. On fait fusionner un répresseur de tétracycline avec le domaine d'inhibition KRAB sous forme de suppresseur afin de réguler avec précision le système double-hybride inverse des cellules mammifères. La liaison d'une protéine chimère avec la séquence opérationnelle de tétracycline se trouvant dans un promoteur supprime entièrement l'expression de deux protéines interactives. Lorsqu'un inducteur et un agent perturbateur de l'interaction protéine-protéine candidat, notamment un médicament, sont ajoutés dans une culture cellulaire, le gène correspondant est soit activé par l'interaction de la protéine-paire si le médicament est inefficace, soit reste inactif en raison de la perturbation de l'interaction protéine-protéine que provoque le médicament efficace. Les plasmides pour le suppresseur et le gène correspondant sont intégrés dans des chromosomes. Les gènes hybrides pour l'expression des protéines interactives sont transfectés de manière stable ou transitoire dans les cellules. On a démontré l'utilité de ce système dans le cadre du criblage de médicaments, notamment de médicaments d'inhibition enzymatique grâce aux deux interactions très caractérisées du type I du récepteur pour TGF beta avec FKPB12 et le récepteur EGF avec P85. L'interaction entre TGF beta RI et FKPB12 ou entre le récepteur EGF et p85 est perturbée par FK506 et l'inhibiteur de kinase AG1478 respectivement. Le système double-hybride inverse mammifère de cette invention peut également être utilisé pour le criblage de composés à haut rendement qui perturbe les interactions protéine-protéine.
Shen Shi-Hsiang
Zhao Hui-Fen
Borden Ladner Gervais Llp
National Research Council Of Canada
LandOfFree
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