C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 5/04 (2006.01) A01N 3/00 (2006.01) C12P 17/02 (2006.01) C40B 40/00 (2006.01)
Patent
CA 2223959
The present invention relates to methods for cryopreserving plant cells and to methods for recovering viable plant cells from long or short term cryopreservation. Plant cells to be cryopreserved can be grown in culture and pretreated with a solution containing a cryoprotective agent and, optionally, a stabilizer. Stabilizers are preferably membrane stabilizers such as ethylene inhibitors, oxygen radical scavengers and divalent cations. Cells can also be stabilized by subjecting the culture to a heat shock. Pretreated cells are acclimated to a reduced temperature and loaded with a cryoprotective agent such as DMSO, propylene glycol or polyethylene glycol. Loaded cells are incubated with a vitrification solution which, for example, comprises a solution with a high concentration of the cryoprotective agent. Vitrified cells retain less than about 20 % water content and can be frozen at cryopreservation temperatures for long periods of time without significantly altering the genotypic or phenotypic character of the cells. Plant cells may also be cryopreserved by lyophilizing cells prior to exposure to a vitrification solution. The combination of lyophilization and vitrification removes about 80 % to about 95 % of the plant cell's water. Cells can be successfully cryopreserved for long periods of time and viably recovered. The invention also relates to methods for the recovery of viable plant cells from cryopreservation. Cells are thawed to about room temperature and incubated in medium containing a cryoprotective agent and a stabilizer. Thecryoprotective agent is removed and the cells successfully incubated and recovered in liquid or semi-solid growth medium. The invention also relates to the cryopreserved cells and to viable plantcells which have been recovered from long or short term cryopreservation.
L'invention concerne des procédés de cryoconservation de cellules végétales et des procédés de récupération de cellules végétales viables cryoconservées à long ou à court terme. On peut cultiver les cellules végétales que l'on veut cryoconserver et les traiter au préalable avec une solution qui contient un agent cryoprotecteur et, éventuellement, un stabilisateur. Les stabilisateurs sont de préférence des stabilisateurs de la membrane tels que des inhibiteurs d'éthylène, des adsorbants des radicaux d'oxygène et des cations bivalents. On peut également stabiliser les cellules en les soumettant à un choc thermique. On habitue les cellules traitées au préalable à une température réduite et on les charge d'un agent cryoprotecteur tel que DMSO, propylène glycol ou polyéthylène glycol. On incube les cellules chargées avec une solution de vitrification pouvant être par exemple une solution qui contient une haute concentration d'agent cryoprotecteur. Les cellules vitrifiées gardent moins de 20 % d'eau et peuvent être congelées à des températures de cryoconservation pendant de longues périodes sans que leur caractère génotypique ou phénotypique soit altéré de manière significative. On peut également cryoconserver des cellules végétales en lyophilisant les cellules avant de les exposer à la solution de vitrification. L'association d'une étape de lyophilisation à une étape de vitrification permet d'éliminer entre 80 % et 95 % environ de l'eau contenue dans les cellules végétales. On peut ainsi cryoconserver avec succès les cellules pendant de longues périodes et les récupérer dans un état viable. L'invention concerne également des procédés de récupération de cellules végétales viables cryoconservées. On décongèle les cellules jusqu'à environ la température ambiante et on les incube dans un milieu qui contient un agent cryoprotecteur et un stabilisateur. On élimine l'agent cryoprotecteur et on incube et récupère avec succès les cellules dans un milieu de culture liquide ou semi-solide. L'invention concerne également les cellules cryoconservées et les cellules végétales viables récupérées après leur cryoconservation à long ou à court terme.
Bare Christopher B.
Kadkade Prakash G.
Schnabel-Preikstas Barbara
Yu Bin
Mbm Intellectual Property Law Llp
Phyton Inc.
Phyton Holdings Llc
LandOfFree
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