A - Human Necessities – 61 – K
Patent
A - Human Necessities
61
K
A61K 47/48 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61K 47/42 (2006.01) C07K 16/18 (2006.01) C07K 16/28 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01)
Patent
CA 2248233
In accordance with the present invention, it has been discovered that a class of anti-dsDNA antibodies, e.g., mAb 3E10, binds membranes of fixed human renal tubular cells, penetrates live murine renal tubular cells in vivo, and localizes in the cell nucleus. mAb 3E10 binds both dsDNA and an extracellular matrix protein expressed in high endothelial venules (i.e., HP8/HEVIN). Previous studies showed both shared and distinct binding determinants in the variable heavy region of mAb 3E10 for DNA and HP8/HEVIN. To independently assess the requirement of HP8/HEVIN and DNA in cellular penetration, site directed mutants of mAb 3E10 VH and Vk were investigated for the ability to penetrate kidney cell lines. The results showed that residues required for binding DNA but not HP8/HEVIN were necessary for antibody penetration, indicating that cellular penetration required the presence of DNA or binding of antibody to a membrane determinant precisely resembling DNA. Antibody Fab penetrates cells, indicating that neither the Fc nor multivalent antibody binding are necessary for cellular penetration. Antibody synthesized in the cytoplasm as a result of deleting heavy and light chain signal peptides is not translocated to the nucleus, indicating the need for a membrane mediated pathway or for post-translational modifications of the antibody. The present invention demonstrates the usefulness of using molecular mutants and/or functional fragments thereof to study the cellular pathways of autoantibody penetration and nuclear localization.
Dans le cadre de la présente invention, il a été découvert qu'une classe d'anticorps anti-ADN bicaténaire, par exemple, les mAb 3E10, lient chez l'homme les membranes des cellules rénales tubulaires fixes, pénètrent in vivo dans les cellules rénales tubulaires murines vivantes, et se localisent dans le noyau de la cellule. Les mAb 3E10 lient l'ADN bicaténaire et la porine exprimée en veinules endothéliales élevées (par exemple, en HP8/HEVIN). Des études précédentes ont porté sur les déterminants liants, tant partagés que distincts, dans les régions lourdes variables de mAb 3E10 pour l'ADN et les HP8/HEVIN. Afin d'estimer de façon indépendante les besoins en HP8/HEVIN et en ADN lors de la pénétration cellulaire, on a étudié la capacité de pénétration des mutants dirigés de mAb 3E10 des régions lourdes variables (VH) et légères variables (Vk) dans les lignées de cellules rénales. Les résultats ont montré que la pénétration des anticorps demandait la présence de résidus nécessaires pour lier l'ADN mais pas les HP8/HEVIN, ce qui indique que la pénétration cellulaire nécessite la présence de l'ADN ou d'un déterminant liant l'anticorps à la membrane qui ressemblerait exactement à l'ADN. L'anticorps Fab pénètre dans la cellule, indiquant que ni le Fc, ni la liaison d'un anticorps multivalent ne sont nécessaires pour la pénétration des cellules. L'anticorps synthétisé dans le cytoplasme et résultant de la destruction de peptides signal des chaînes lourde et légère n'est pas transloqué vers le noyau, ce qui indique la nécessité d'avoir un mécanisme d'action à médiation par la membrane ou des modifications de l'anticorps effectuées après la traduction. La présente invention démontre l'utilité de l'utilisation de mutants moléculaires et/ou de leurs fragments fonctionnels dans l'étude des mécanismes cellulaires de pénétration des auto-anticorps et de la localisation dans le noyau.
Gowling Lafleur Henderson Llp
The Regents Of The University Of California
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1720750