Detection of nucleic acids by fluorescence quenching

Details Detection of nucleic acids by fluorescence quenching Detection of nucleic acids by fluorescence quenching

C - Chemistry, Metallurgy

12

Q

C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/00 (2006.01)

Patent

CA 2234690

A detector oligonucleotide having a sequence which forms an intramolecularly base-paired secondary structure is described for use in detecting nucleic acid target sequences and target sequence amplification. The detector oligonucleotide is further modified by linkage to two dyes which form a donor/acceptor dye pair. The two dyes are positioned on the detector oligonucleotide such that they are in close spatial proximity in the base-paired, folded secondary structure, thereby causing quenching of donor fluorescence. The detector oligonucleotide may optionally further comprise a restriction endonuclease recognition site (RERS) which remains partially or entirely single-stranded in the base-paired secondary structure. The RERS is flanked by the two dyes. In the presence of target, the base-paired secondary structure is unfolded or linearized, increasing the distance between the donor and acceptor dyes and causing a change in fluorescence of the donor and/or the acceptor. If an RERS is present, it is rendered double-stranded in the presence of target, allowing cleavage or nicking by a restriction endonuclease and separation of the two dyes onto separate nucleic acid fragments. This may further contribute to the magnitude of the change in fluorescence.

Est décrit un détecteur d'oligonucléotide ayant une séquence qui forme une structure secondaire complémentaire sur le plan intramoléculaire destiné à détecter des séquences d'acide nucléique cibles et l'amplification des séquences cibles. Le détecteur d'oligonucléotides est en outre modifié par liaison avec deux colorants qui forment une paire de colorants donneur/receveur. Les deux colorants sont positionnés sur le détecteur d'oligonucléotides, de façon à être à proximité étroite sur le plan spatial dans la structure secondaire complémentaire pliée, entraînant ainsi une extinction de la fluorescence du donneur. Le détecteur d'oligonucléotide peut aussi, de façon facultative, comprendre un site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction (SRER) qui demeure partiellement ou entièrement monocaténaire dans la structure secondaire complémentaire. Le SRER est flanqué par les deux colorants. En présence de la cible, la structure secondaire complémentaire est dépliée ou linéarisée, ce qui augmente la distance entre les colorants donneur et receveur, et entraîne une modification dans la fluorescence du donneur et/ou du receveur. Si un SRER est présent, il devient monocaténaire en présence de la cible, permettant le clivage ou le croisement par une endonucléase de restriction et la séparation des deux colorants en fragments d'acide nucléique distincts. Cela peut encore contribuer à accroître l'importance du changement dans la fluorescence.

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