C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2318880
A method is provided for genotyping a target sequence at at least two allelic sites by a 5' nuclease amplification reaction. In one embodiment, the method includes performing a nucleic acid amplification on a target sequence having at least two different allelic sites using a nucleic acid polymerase having 5'.fwdarw.3' nuclease activity and a primer capable of hybridizing to the target sequence in the presence of two or more sets of allelic oligonucleotide probes wherein: each set of allelic oligonucleotide probes is for detecting a different allelic site of the target sequence, each set of allelic oligonucleotide probes includes two or more probes which are complementary to different allelic variants at the allelic site being detected by the set of probes, the allelic site being 5' relative to a sequence to which the primer hybridizes to the target sequence, and at least all but one of the allelic oligonucleotide probes include a different fluorescer than the other probes and a quencher positioned on the probe to quench the fluorescence of the fluorescer; detecting a fluorescence spectrum of the amplification; calculating a fluorescence contribution of each fluorescer to the fluorescence spectrum; and determining a presence or absence of the different allelic variants at the two or more different allelic sites based on the fluorescence contribution of each fluorescer to the combined fluorescence spectrum.
L'invention a trait à une méthode de génotypage d'une séquence cible sur au moins deux sites alléliques par une réaction d'amplification par 5' nucléase. Dans un mode de réalisation, la méthode consiste à procéder à une amplification d'acide nucléique sur une séquence cible présentant au moins deux sites alléliques différents à l'aide d'un acide nucléique polymérase ayant une activité 5'~3' nucléase et d'une amorce capable de s'hybrider à la séquence cible en présence d'au moins deux ensembles de sondes oligonucléotidiques alléliques, dans laquelle: chaque ensemble de sondes oligonucléotidiques alléliques est destiné à détecter un site allélique différent de la séquence cible, chaque ensemble de sondes oligonucléotidiques alléliques comprend au moins deux sondes complémentaires de différents variants alléliques sur le site allélique détecté par l'ensemble de sondes, le site allélique se situant en position 5' par rapport à une séquence dans laquelle l'amorce s'hybride à la séquence cible, et au moins toutes les sondes oligonucléotidiques alléliques sauf une desdites sondes comprennent un agent de fluorescence différent des autres sondes et un agent d'extinction positionné sur la sonde afin d'éteindre la fluorescence de l'agent fluorescent; à détecter un spectre de fluorescence de l'amplification; à calculer une contribution de fluorescence de chaque agent de fluorescence au spectre de fluorescence; et à déterminer la présence ou l'absence des différents variants alléliques sur au moins deux sites alléliques différents sur la base de la contribution de fluorescence de chaque agent fluorescent au spectre de fluorescence combiné.
Goodsaid Federico
Livak Kenneth J.
Applied Biosystems Llc
Borden Ladner Gervais Llp
Perkin-Elmer Corporation
LandOfFree
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