C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/70 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/74 (2006.01)
Patent
CA 2171096
This invention relates to a method of cloning DNA produced by primer extension including PCR amplified, reverse transcriptase- generated or primer extended synthetic DNA. Specifically, it relates to a method in which alkane diol residue containing olignonucleotide primers are incorporated into DNA by primer extension followed by direct cloning of the target DNA. Following transformation, the host excises the alkane diol residue with its endogenous DNA repair machinery. The method of cloning taught by the present invention is an improvement over existing techniques which require either restriction enzyme digestion of the PCR, RT or primer extended synthetic DNA product, blunt-ended cloning, or the use of restriction sites in the cloning vector which are able to accept PCR products by utilizing the incidental terminal transferaser activity of T. aquaticus DNA polymerase L. The ability to easily close any PCR or RT product into any restriction site with a 5' overhang represents a significant advance over the present state of the art.
L'invention concerne un procédé de clonage d'ADN produit par extension d'amorce comprenant un ADN synthétique amplifié par PCR, généré par transcriptase inverse ou obtenu par extension d'amorce. Plus particulièrement, elle concerne un procédé dans lequel les restes d'alcane diol contenant des amorces oligonucléotidiques sont incorporés dans l'ADN par extension d'amorce suivie par le clonage direct de l'ADN cible. Après la transformation, l'hôte coupe le reste au moyen de son système endogène de réparation d'ADN. Ce procédé de clonage représente une amélioration par rapport à l'état actuel de la technique nécessitant soit une digestion enzymatique de restriction du produit d'ADN synthétique amplifié par PCR, généré par RT ou obtenu par extension d'amorce, un clonage à extrémité franche, soit l'utilisation de sites de restriction dans le vecteur de clonage pouvant accepter des produits de PCR par l'intermédiaire de l'activité de transférase terminale fortuite de l'ADN polymérase I de T. aquaticus. La possibilité de cloner facilement tout produit de PCR ou de RT dans tout site de restriction avec un dépassement en 5' représente un progrès important par rapport à l'état actuel de la technique.
Wallace Robert Bruce
Witney Franklin Richard
Bio-Rad Laboratories Inc.
Fetherstonhaugh & Co.
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1360980