Dna sequencing method

C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q

Patent

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C12Q 1/68 (2006.01) C12N 9/22 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/48 (2006.01)

Patent

CA 2450320

A transcriptional sequence method whereby a high SN ratio can be obtained in sequence analysis with the use of capillary and longer and more accurate base sequence data can be obtained in a single reaction. More specifically, a method of determining a DNA base sequence involving the step of obtaining a nucleic acid transcription product with the use of an RNA polymerase, a template DNA having a promoter sequence for the RNA polymerase and substrates of the RNA polymerase. The substrates of the RNA polymerase involve a 3~- deoxynucleotide derivative. The RNA polymerase is a mutant RNA polymerase derived from a wild type RNA polymerase by substitution of at least one amino acid or deletion of at least one amino acid. The substitution and/or deletion of the amino acid(s) are performed so that the mutant RNA polymerase has an enhanced capability of incorporating the 3~-deoxynucleotide derivative as a substrate compared with the corresponding wild type RNA polymerase.

L'invention concerne un procédé de séquençage transcriptionnel selon lequel on peut obtenir un rapport signal/bruit élevé dans l'analyse de séquences au moyen d'un capillaire et, par ailleurs, des données de séquences nucléotidiques plus longues et plus précises dans une réaction simple. L'invention concerne en particulier un procédé pour déterminer une séquence nucléotidique d'ADN, consistant à obtenir un produit de transcription d'acide nucléique au moyen d'une ARN polymérase, une matrice d'ADN comportant une séquence promotrice pour l'ARN polymérase et des substrats de l'ARN polymérase. Les substrats de l'ARN polymérase comprennent un dérivé de 3'-désoxynucléotide. L'ARN polymérase est une ARN polymérase mutante dérivée d'une ARN polymérase de type sauvage par substitution d'au moins un acide aminé ou délétion d'au moins un acide aminé. La substitution et/ou la délétion des acides aminés sont effectuées de sorte que l'ARN polymérase mutante présente une capacité améliorée à incorporer le dérivé de 3'-désoxynucléotide comme substrat par rapport à l'ARN polymérase de type sauvage correspondante.

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