C - Chemistry – Metallurgy – 07 – K
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
07
K
C07K 16/00 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C40B 50/06 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01) C12N 15/13 (2006.01)
Patent
CA 2549982
Methods of amplifying nucleic acid have now been discovered which include the steps of: a) annealing a primer to a template nucleic acid sequence, the primer having a first portion which anneals to the template and a second portion of predetermined sequence; b) synthesizing a polynucleotide that anneals to and is complementary to the portion of the template between the location at which the first portion of the primer anneals to the template and the end of the template, the polynucleotide having a first end and a second end, wherein the first end incorporates the primer; c) separating the polynucleotide synthesized in step (b) from the template; d) annealing a nested oligonucleotide to the second end of the polynucleotide synthesized in step (b), the nested oligonucleotide having a first portion that anneals to the second end of the polynucleotide and a second portion having the same predetermined sequence as the second portion of the primer; e) extending the polynucleotide synthesized in step (b) to provide a terminal portion thereof that is complementary to the predetermined sequence; and f) amplifying the extended polynucleotide using a single primer having the predetermined sequence.. In particularly useful embodiments, the methods are used to amplify a repertoire of IgA antibodies.
Selon l'invention, on a découvert des méthodes d'amplification d'un acide nucléique consistant (a) à hybrider une amorce à une séquence d'acide nucléique de matrice, cette amorce comprenant une première partie s'hybridant à la matrice et une seconde partie de séquence prédéterminée, (b) à synthétiser un polynucléotide qui s'hybride à une partie de la matrice et qui en est complémentaire, cette partie se trouvant entre l'emplacement où la première partie de l'amorce s'hybride à la matrice et l'extrémité de la matrice, le polynucléotide possédant une première extrémité et une seconde extrémité, la première extrémité comportant l'amorce, (c) à séparer le polynucléotide synthétisé dans l'étape (b) de la matrice, (d) à hybrider un oligonucléotide niché à la seconde extrémité du polynucléotide synthétisé dans l'étape (b), l'oligonucléotide niché possédant une première partie s'hybridant à la seconde extrémité du polynucléotide et une seconde partie comprenant la même séquence prédéterminée que la seconde partie de l'amorce, (e) à étendre le polynucléotide synthétisé dans l'étape (b) en vue de l'obtention d'une partie terminale correspondante complémentaire de la séquence prédéterminée, et (f) à amplifier le polynucléotide étendu au moyen d'une amorce unique comprenant la séquence prédéterminée. Dans des modes de réalisation particulièrement utiles, ces méthodes sont utilisées pour amplifier un répertoire d'anticorps IgA.
Bowdish Katherine S.
Frederickson Shana
Maruyama Toshiaki
Renshaw Mark
Alexion Pharmaceuticals Inc.
Bereskin & Parr Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
LandOfFree
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