C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07K 14/245 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01)
Patent
CA 2465724
The present invention provides methods of isolating of leader peptides capable of directing export of heterologous proteins from the bacterial cytoplasm. The methods rely on the screening of libraries of putative leader peptides or of leader peptide mutants for sequences that allow rapid export and thus can rescue a short-lived reporter protein from degradation in the cytoplasm. The mutant leader peptides identified herein are shown to confer significantly higher steady state levels of export not only for short-lived reporter protein but also for other stable, long-lived proteins. These leader peptides can be used to direct or enhance protein secretion. The present invention further discloses methods for the export of cytoplasmically folded protein via the Tat pathway. Proteins having disulfide bonds are first folded within the cytoplasm in suitable oxidizing mutant strains. Such cytoplasmically pre-folded proteins containing disulfide bonds are then exported via the Tat pathway.
L'invention concerne des procédés d'isolement de peptides leader pouvant diriger l'exportation de protéines hétérologues à partir du cytoplasme bactérien. Lesdits procédés se fondent sur le criblage de bibliothèques de peptides leader putatifs ou de mutants de peptides leader pour des séquences qui permettent une exportation rapide et peuvent ainsi empêcher la dégradation d'une protéine reporter à durée de vie courte dans le cytoplasme. Lesdits peptides leader mutants identifiés dans la présente invention peuvent conférer de manière significative des niveaux d'états stables d'exportation plus élevés non seulement pour une protéine reporter à durée de vie courte mais aussi pour d'autres protéines stables à durée de vie longue. Lesdits peptides leader peuvent être utilisés pour diriger ou augmenter la sécrétion des protéines. L'invention concerne de plus des procédés d'exportation de protéines pliées de manière cytoplasmique par l'intermédiaire d'une voie Tat. Des protéines présentant des liaisons disulfure sont pliées en premier à l'intérieur du cytoplasme dans des souches mutantes appropriées oxydantes. Lesdites protéines pré-pliées de manière cytoplasmique qui contiennent des liaisons disulfure sont alors exportées par l'intermédiaire de la voie Tat.
Delisa Matthew
Georgiou George
Borden Ladner Gervais Llp
Research Development Foundation
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1517561