C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/861 (2006.01)
Patent
CA 2366914
In the present invention, viruses, plasmids or both are constructed which contain viral DNA, either at least one head-to-head ITR junction, recombinase recognition sites positioned such that site-specific recombination between recombinase recognition sites in separate plasmids results in generation of infectious viral DNA at high-efficiency in cotransfected host cells that have been engineered to express a site-specific recombinase, or both. Because of the high-efficiency and specificity of the Cre enzyme, the FLP enzyme, or both, suitably engineered plasmids can be readily recombined to produce infectious virus at high--efficiency in cotransfected 293 cells, without, at the same time, producing wild-type adenovirus, with the attendant problems for removal thereof. Use of recombinases besides Cre or FLP, and recombinase recognition sites besides lox or frt sites, and use of cells other than 293 cells are also disclosed and enabled, as are kits incorporating the site-specific vector system, as well as compositions and methods for using such compositions as vaccines or in gene therapeutic applications. Enhancements in the efficiency of both site-specific and homologous recombination are provided by inclusion of at least one head-to-head ITR junction.
Selon cette invention, on construit des virus et/ou des plasmides qui contiennent un ADN viral et dans lesquels il existe soit au moins une jonction ITR tête-à-tête ou des sites de reconnaissance de recombinases, disposés de manière à ce que la recombinaison spécifique aux sites entre les sites de reconnaissance de recombinases dans les plasmides séparés mène à la génération hautement efficace d'un ADN viral infectieux dans les cellules hôtes cotransférées manipulées pour exprimer une recombinase spécifique au site, soit les deux. Grâce à l'efficacité et à la spécificité élevées de l'enzyme Cre, de l'enzyme FLP ou des deux, on peut aisément recombiner les plasmides manipulés en conséquence pour produire très efficacement un virus infectieux dans les cellules 293 cotransférées, et ce sans pour autant produire d'adénovirus de type sauvage ni de créer de problèmes liés à l'enlèvement de ce dernier. L'invention concerne aussi l'utilisation de recombinases aux côtés des Cre et des FLP et de sites de reconnaissance de recombinases outre que ceux lox ou frt ainsi que l'utilisation de cellules autres que les cellules 293, de même que des kits comprenant le système de vecteurs spécifiques au site et des compositions et procédés pour utiliser ces compositions en tant que vaccins ou dans des applications de thérapie génique. L'invention se rapporte également à l'amélioration de l'efficacité de la recombinaison spécifique au site et de la recombinaison homologue, et ce grâce à l'inclusion d'au moins une jonction ITR tête-à-tête.
Graham Frank L.
Ng Philip
Parks Robin
Advec Inc.
Macrae & Co.
Merck & Co. Inc.
LandOfFree
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