C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/85 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01)
Patent
CA 2423082
Sustained transgene expression will be required for the vast majority of genetic diseases being considered for gene therapy. The initially high levels of expression attained with plasmid DNA (pDNA) vectors containing viral promoters, such as that from cytomegalovirus (CMV), decline precipitously to near background levels within 2 to weeks. We have constructed pDNA vectors containing the human cellular ubiquitin B (Ub) promoter and evaluated their expression in the mouse lung. Cationic lipid-pDNA complexes were instilled intranasally (IN) or injected intravenously (IV) into immunodeficient BALB/c mice. Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter gene expression from the Ub promoter was initially very low at day 2 post-administration but by day 35 exceeded the level of expression attained from a CMV promoter vector by 4- to 9-fold. Appending a portion of the CMV enhancer 5' of the Ub promoter (CMV- Ub) increased CAT expression to nearly that of the CMV promoter and expression persisted in the lung for at least three months, with 50% of day 2 levels remaining at day 84. In the liver, expression from the CMV-Ub hybrid promoter was sustained for 42 days. Since previous studies have shown that eliminating immunostimulatory CpG motifs in pDNA vectors reduces their toxicity, we constructed a CpG deficient version of the CMV-Ub vector expressing alphagalactosidase A, the enzyme that is deficient in Fabry disease, a lysosomal storage disorder. After IN or IV administration, levels of alpha- galactosidase A from this vector were not only undiminished but increased 500% to 1500% by day 35. These results suggest that CpG-reduced plasmid vectors containing a CMV-Ub hybrid promoter may provide the long-term expression and efficacy required for a practical gene therapeutic.
L'expression transgénique soutenue sera nécessaire pour la grande majorité des maladies génétiques étudiées dans le cadre de la thérapie génique. Les niveaux d'expression d'origine élevés atteints avec des vecteurs d'ADN plasmidique (ADNp) contenant des promoteurs viraux, tels que ceux du cytomégalovirus (CMV), déclinent rapidement jusqu'à des niveaux proches du minimum en deux semaines. Nous avons construit des vecteurs d'ADNp contenant le promoteur d'ubiquitine B (Ub) cellulaire humain et évalué leur expression dans les poumons d'une souris. On a instillé dans les narines (IN) ou injecté dans les veines (IV) de souris BALB/c immunodéficientes des complexes d'ADNp lipidique cationique. L'expression du gène rapporteur de chloramphénicol acétyltransférase (CAT) du promoteur Ub était à l'origine très basse le deuxième jour suivant l'administration, mais au trente-cinquième jour suivant cette administration elle dépassait le niveau d'expression atteint à partir d'un vecteur promoteur de CMV, multipliant le score par un facteur compris entre 4 et 9. En ajoutant une partie de l'amplificateur 5' de CMV du promoteur de Ub (CMV-Ub) on augmente l'expression CAT presque au niveau de celle du promoteur de CMV, et l'expression dure dans les poumons pendant au moins trois mois, avec 50 % des niveaux du deuxième jour qui subsistent au quatre vingt quatrième jour. Dans le foie, l'expression du promoteur hybride CMV-Ub était soutenue pendant 42 jours. Depuis que des études précédentes ont montré que l'élimination des motifs structurels dans les vecteurs D'ADNp réduisait leur toxicité, nous avons construit une version carencée en CpG du vecteur CMV-Ub exprimant l'alphagalactosidase A, l'enzyme qui manque dans la maladie de Fabry, laquelle est un trouble du stockage lysosomial. Après une administration IN ou IV, non seulement les niveaux d'alpha-galctosidase A de ces vecteurs n'avaient pas diminué, mais ils avaient augmenté de 500 % à 1500 % au trente cinquième jour. Ces résultats donnent à penser que des vecteurs plasmidiques à CpG réduite contenant un promoteur hybride CMV-Ub peuvent fournir l'expression et l'efficacité de long terme requises pour une thérapie génique de pratique.
Yew Nelson
Genzyme Corporation
Gowling Lafleur Henderson Llp
LandOfFree
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