C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01)
Patent
CA 2243759
An improved assay system for homogeneous assay detection and/or measuring target nucleic acid sequence replicated in a PCR amplification procedure is provided by employing a nucleic acid polymerase having 5' to 3' exonuclease activity and devoid of 3' to 5' exonuclease activity, oligonucleotide analytical probe blocked against chain extension at its 3' terminus and labeled at its 5' terminus with an energy transfer donor fluorophore, and oligonucleotide detection probe labeled at its 3' terminus with an energy transfer acceptor fluorophore, said probes being complements of each other but differing in nucleotide length so that their Tm's are at least 10 ~C apart, the Tm of the oligonucleotide analytical probe is equal to or greater than the Tm's of the oligonucleotide primers used in the PCR amplification procedure and the Tm of the oligonucleotide detection probe is lower than the temperature required to conduct the PCR thermal cycling steps of the PCR amplification procedure so that during the PCR thermal cyclic steps 5' fluorophore labeled nucleotide fragments are produced during the PCR extension phase by the 5' to 3' exonuclease activity of the nucleic acid polymerase on oligonucleotide analytical probe annealed to denatured strands of the target nucleic acid sequence. Detection of measurement of either (a) the 5' fluorophore labeled nucleotide fragments produced during the thermal cyclic steps and measured by fluorescence polarization or (b) oligonucleotide analytical probe hybridized to oligonucleotide detection probe measured spectrophotometrically by energy transfer measurement, provide a measure of the amount of oligonucleotide analytical probe used up in the amplification of the target nucleic acid sequence and thus provide a measure of amount of target nucleic acid sequence amplified in the PCR replication procedure.
La présente invention concerne un perfectionnement d'un système de dosage homogène permettant de détecter et/ou de mesurer une séquence d'acide nucléique cible répliquée selon un procédé d'amplification par réaction en chaîne de la polymérase. On utilise pour cela une polymérase d'acide nucléique présentant une activité exonucléase de 5' en 3', et exempte d'activité exonucléase de 3' en 5', une sonde analytique oligonucléotide n'admettant pas l'extension de chaîne au niveau de la terminaison 3' et marquée au niveau de la terminaison 5' d'un fluophore donneur à transfert d'énergie, et enfin une sonde de détection marquée au niveau de la terminaison 3' d'un fluophore accepteur à transfert d'énergie. Ces sondes, qui sont complémentaires l'une de l'autre, diffèrent quant à leur longueur nucléotide jusqu'à présenter un écart d'au moins 10 ·C entre leurs températures de fusion. La température de fusion de la sonde analytique oligonucléotide est au moins égale à la température de fusion des amorces utilisées pour le processus d'amplification par réaction en chaîne de la polymérase. En outre, la température de fusion de la sonde de détection oligonucléotide est inférieure à la température requise pour mener les opérations de pompage thermique de la réaction en chaîne de la polymérase. Il en résulte que pendant les opérations de pompage thermique de la réaction en chaîne de la polymérase, il y a production de fragments oligonucléotides marqués en 5' de fluophores, et ce, pendant la phase d'extension de la réaction en chaîne de la polymérase en raison de l'activité exonucléase de 5' en 3' de la polymérase sur la sonde analytique oligonucléotide reconstituée en des brins dénaturés de la séquence d'acide nucléique cible. La détection ou la mesure, (a) soit des fragments oligonucléotides marqués en 5' de fluophores, produits pendant les opérations de pompage thermique de la réaction en chaîne de la polymérase et mesurés par polarisation de fluorescence, (b) soit de la sonde analytique oligonucléotide hybridée en sonde de détection oligonucléotide mesurée par spectrophotométrie selon un procédé de mesure de transfert d'énergie, donne une mesure de la quantité de sonde analytique oligonucléotide consommée par l'amplification de la séquence d'acide nucléique cible, et donne donc une mesure de la quantité de séquence d'acide nucléique cible amplifiée au cours du processus de réplication par réaction en chaîne de la polymérase.
Applied Biosystems Llc
Perkin-Elmer Corporation The
Sim & Mcburney
LandOfFree
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