High specificity homocysteine assays for biological samples

C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q

Patent

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C12Q 1/25 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12N 9/10 (2006.01) C12Q 1/527 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)

Patent

CA 2296734

The novel methods of the invention involve use of particular homocysteinase enzymes that permit the determination of homocysteine concentrations in biological samples without interference from the concentrations of cysteine and/or of methionine that are routinely present in such samples. There is also provided a diagnostic kit for use in determining the amount of homocysteine in a biological sample comprising (a) a homocysteinase having the aformentioned characteristics, and (b) at least one reagent capable of being used to determine the amount of product formed in the homocysteinase reaction. In a further aspect, the homocysteinase is provided as a chimeric molecule that comprises amino acid subsequences derived from, or patterned on, more than one homocysteinase, and which is typically produced from a chimeric polynucleotide that encodes therefor. Additional enhancements in homocysteine assay methodology include use of the enzyme .gamma.-glutamylcysteine synthetase to further limit any interference from cysteine present in the biological samples.

L'invention concerne de nouveaux procédés faisant effet à des homocystéinases particulières qui permettent de déterminer les concentrations d'homocystéine dans des échantillons biologiques sans qu'il y ait des interférences dues à la cystéine et/ou à la méthionine ordinairement présentes dans ces échantillons. L'invention concerne également un kit de diagnostic, utilisé pour déterminer la quantité d'homocystéine dans un échantillon biologique et comprenant: (a) une homocystéinase possédant les caractéristiques susmentionnées; (b) au moins un réactif pouvant être utilisé pour déterminer la quantité de produit formé lors de la réaction de l'homocystéinase. Dans un autre aspect, l'homocystéinase se présente comme une molécule chimère qui comprend des sous-séquences d'acides aminés dérivées de plusieurs homocystéinases ou construites sur leur modèle; en règle générale, cette molécule est produite à partir d'un polynucléotide chimère codant pour les homocystéinases. D'autres améliorations apportées aux méthodes de dosage d'homocystéine comprennent l'utilisation de la .gamma.-glutamylcystéine synthétase pour limiter encore davantage toute interférence due à la présence de cystéine dans les échantillons biologiques.

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