C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2250105
A high volume substrate-based in-situ hybridization assay has been developed, utilizing scintillant containing microplates. The technique has the sensitivity to reliably detect specific mRNA transcripts at the level of 10-20 copies per cell. High specific activity antisense riboprobes specific for c- fos and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), as well as a non- homologous vector derived control probe were used to compare mRNA levels in quiesced rat A-10 smooth muscle cells after stimulation with fetal calf serum (FCS) or platelet-derived growth factor (PDGF). Maximal c-fos induction was shown to occur following stimulation of with 30 ng/ml of PDGF or 10 % FCS, corresponding to a signal from the c-fos probe of 700 cpm. The non-homologous control background of 50 cpm and the GAPDH signals of 1700 cpm were independent of stimulation with PDGF or serum. Using PDGF, at 30 ng/ml, quiesced cells were stimulated at various times to provide an induction time- course for c-fos mRNA which peaked at 30 minutes and decreased to less than 50 % of this by 3 hours; a return to background level expression was apparent after 6 hours. Comparison with parallel northern blotting experiment showed this in-situ assay to be at least a 20-fold more sensitive and much more rapid to perform.
Analyse d'hybridation in situ à partir d'un substrat volumineux, à l'aide de microplaques contenant du scintillant. La technique est suffisamment sensible pour qu'on puisse détecter des transcrits d'ARNm spécifiques au taux de 10-20 exemplaires par cellule. On utilise des ribosondes antisens à activité spécifique élevée spécialisées pour c-fos et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ainsi qu'une sonde de contrôle dérivée d'un vecteur non homologue pour comparer les taux d'ARNm dans des cellules de muscle lisse A-10 d'un rat mises en état de quiescence après stimulation au moyen du sérum embryonnaire de veau (FCS) ou de facteur de croissance d'origine plaquettaire (PDGF). Il a été montré qu'une induction c-fos maximale se produit après une stimulation de 30 ng/ml de PDGF ou de 10 % de FCS, ce qui correspond à un signal émis par la sonde c-fos de 700 cpm. Le milieu de contrôle non homologue de 50 cpm et les signaux GAPDH de 1700 cpm étaient indépendants de la stimulation par PDGF ou par sérum. Avec l'apport de PDGF, à 30 ng/ml, les cellules mises en état de quiescence étaient stimulées à différents moments pour donner un schéma temporel d'induction pour l'ARNm c-fos qui culminait à 30 minutes et s'abaissait à moins de 50 % de la valeur de crête au bout de 3 heures; un retour au même taux d'expression que le niveau du milieu a été observé au bout de 6 heures. La comparaison avec une analyse réalisée par transfert de Northern menée en parallèle a montré que la méthode d'analyse in situ décrite était au moins 20 fois plus sensible et également beaucoup plus rapide.
Harris Douglas W.
Jones David A.
Kenrick Michael K.
Thomas Nicholas
Amersham International Plc
Macrae & Co.
Nycomed Amersham Plc
Pharmacia & Upjohn Company
LandOfFree
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