C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/09 (2006.01)
Patent
CA 2717618
The present invention provides a method which can achieve the homologous recombination of a gene of interest selectively, and a recombinant DNA molecule produced by the method. A homologous recombination method which uses a PCR product and a linearlized vector is disclosed. The PCR product comprises a sequence for a target gene and amplification primer sequences P1 and P2 on both terminal ends. The vector contains homologous recombination regions VP1 and VP2 which respectively comprises nucleotide sequences homologous to the amplification primer sequences P1 and P2 of the PCR product, and a homologous recombination region VT1 which comprises a nucleotide sequence homologous to a sequence T1 that is a part of sequence in the PCR product internal to P1 on the terminal side of VP1 and/or a homologous recombination region VT2 which comprises a nucleotide sequence homologous to a sequence T2 that is a part of sequence in the PCR product internal to P2 on the terminal side of VP2 (provided that at least one of Ti and T2 has a nucleotide sequence specific to the target gene). The method comprises subjecting the PCR product to a homologous recombination reaction to insert the PCR product into the vector, thereby producing a recombinant DNA molecule in which the PCR product of interest is specifically inserted into the vector. Also disclosed a cloning method for producing the recombinant DNA molecule comprising the vector and the PCR product of interest specifically inserted into the vector by the homologous recombination method, and amplifying the recombinant DNA molecule.
L'invention porte sur un procédé qui permet d'obtenir la recombinaison homologue d'un gène d'intérêt de façon sélective. L'invention porte également sur une molécule d'ADN recombinante obtenue par le procédé. Plus précisément, l'invention porte sur un procédé de recombinaison homologue qui utilise un produit de PCR et un vecteur linéarisé. Le produit de PCR comporte une séquence pour un gène cible et des séquences d'amorce d'amplification P1 et P2 attachées aux deux extrémités terminales de la séquence pour le gène cible. Le vecteur a des régions de recombinaison homologue VP1 et VP2 respectivement comportant des séquences nucléotidiques homologues des séquences d'amorce d'amplification P1 et P2 contenues dans le produit de PCR, ainsi qu'une région de recombinaison homologue VT1 comportant une séquence nucléotidique homologue d'une séquence T1 qui est une séquence interne partielle de P1 sur le côté terminal de VP1 et/ou une région de recombinaison homologue VT2 comportant une séquence nucléotidique homologue d'une séquence T2 qui est une séquence interne partielle de P2 sur le côté terminal de VP2 (à la condition que T1 et/ou T2 ait une séquence nucléotidique spécifique du gène cible). Le procédé comporte l'opération consistant à soumettre le produit de PCR à une réaction de recombinaison homologue pour introduire le produit de PCR dans le vecteur, permettant ainsi de produire une molécule d'ADN recombinant comportant le vecteur et le produit de PCR souhaité introduit de façon spécifique dans le vecteur. L'invention porte également sur un procédé de clonage pour produire la molécule d'ADN recombinant comportant le vecteur et le produit de PCR souhaité introduit de façon spécifique dans le vecteur par la méthode de recombinaison homologue et pour amplifier la molécule d'ADN recombinant.
Isobe Masaharu
Kurosawa Nobuyuki
Fetherstonhaugh & Co.
National University Corporation University Of Toyama
LandOfFree
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