C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/54 (2006.01) C12N 9/12 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2593018
The invention relates to compositions, methods, and kits for hot start polynucleotide synthesis, including extension of primed polynucleotide templates and polymerase chain reaction (PCR). Hot start is provided by a thermally inactivated blocking polymerase protein that binds primed polynucleotide templates and prevents their access to a thermostable nucleic acid polymerase. High temperatures employed in the synthesis reaction cause the blocking polymerase to denature, thereby permitting the action of a thermostable processive polymerase. Compositions of the invention include a specific blocking polymerase protein which is a mutant of the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase. The mutant is essentially devoid of polymerase activity, processivity, and 3' to 5' exonuclease activity. Use of the thermally inactivated blocking polymerase together with a thermostable polymerase reduces non-specific priming and accumulation of unwanted amplification products, increasing the specificity and sensitivity of the synthesis reaction.
L'invention concerne des compositions, des méthodes et des trousses destinées à une synthèse de polynucléotides à amorçage à chaud, y compris l'extension de modèles polynucléotides amorcés et une réaction en chaîne de la polymérase (PCR). L'amorçage à chaud est obtenu à l'aide d'une protéine polymérase de blocage désactivée par voie thermique, qui fixe les modèles polynucléotidiques amorcés et évite leur accès à une polymérase d'acide nucléique thermostable. Les températures élevées utilisées dans la réaction de synthèse permettent d'obtenir la dénaturation de la polymérase de blocage et, ainsi, une action de la polymérase thermostable possédant une capacité de réaction. L'invention concerne également des compositions comprenant une protéine polymérase de blocage spécifique qui est un mutant du fragment Klenow de l'ADN polymérase d'E. coli. Ce mutant ne présente pas d'activité polymérase, ni de capacité de réaction, et d'activité exonucléasique 3' à 5'. L'utilisation de la polymérase de blocage désactivée par voie thermique avec une polymérase thermostable permet de réduire l'amorçage non-spécifique et l'accumulation de produits d'amplification indésirables, ce qui augmente la spécificité et la sensibilité de la réaction de synthèse.
Stratagene California
Torys Llp
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1390405