C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/09 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/67 (2006.01) C12N 15/81 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G06F 17/00 (2006.01)
Patent
CA 2457038
A method of search for and identification of a eukaryotic IRES element active in cap-independent translation of RNA in eukaryiotic cells is provided, comprising the following steps: i)screening eukaryotic mRNA sequences or corresponding DNA sequences for a potential IRES element having a block of nucleotides having: a) a length of at least 30 nucleotides; b) an adenine nucleotide content of at least 40 mol-%; and c) a pyrimidine nucleotide content of less than 40 mol-%; ii) inserting said potential IRES element into a linear dicistronic construct between an upstream gene and a downstream GUS reporter gene, whereby said potential IRES element is positioned for IRES- dependent translation of said downstream GUS gene and whereby said upstream gene is preceded by a stable hairpin structure to prevent IRES-independent translation of said genes; and iii) testing said potential IRES element for IRES-dependent translation of said GUS gene in a rabbit reticulocyte lysate or in a wheat germ extract in vitro translation assay, whereby GUS gene expression is quantitated preferably relative to a construct having a reference IRES element or a non-IRES element between said upstream gene and said GUS gene.
L'invention concerne un procédé de recherche et d'identification d'un élément IRES eucaryote actif dans la traduction d'ARN indépendante de la coiffe dans des cellules eucaryotes. Ce procédé comprend les étapes consistant: i) à cribler des séquences d'ARNm eucaryotes ou des séquences d'ADN correspondantes pour un élément IRES potentiel comprenant un bloc de nucléotides possédant: a) une longueur d'au moins 30 nucléotides, b) un contenu d'adénonucléotide égal ou supérieur à 40 % molaire, et c) un contenu de nucléotide à pyrimidine inférieur à 40 % molaire, ii) à insérer cet élément IRES potentiel dans une construction dicistronique linéaire entre un gène en amont et un gène rapporteur GUS en aval, cet élément IRES potentiel étant positionné pour une traduction dépendante d'IRES de ce gène GUS en aval, et le gène en amont étant précédé d'une structure en épingle à cheveux stable pour empêcher la traduction indépendante d'IRES de ces gènes, et iii) à tester cet élément IRES potentiel pour la traduction dépendante d'IRES du gène GUS dans une analyse de traduction <i>in vitro</i> d'un lysat de réticulocyte de lapin ou d'un extrait de germe de blé, l'expression du gène GUS étant quantifiée de préférence par rapport à une construction possédant un élément IRES de référence ou un élément non IRES situé entre le gène en amont et le gène GUS.
Atabekov Joseph
Dorokhov Yurii
Gleba Yuri
Ivanov Peter
Skulachev Maxim
Icon Genetics Inc.
Smart & Biggar
LandOfFree
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