C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 9/52 (2006.01) A61K 38/16 (2006.01) C07K 14/31 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01)
Patent
CA 2319693
Methods for the identification, production and use of staphylokinase derivatives characterized by a reduced immunogenicity after administration in patients and that can be administered by single intravenous bolus injection. The derivatives of the invention are obtained by preparing a DNA fragment comprising at least the part of the coding sequence of staphylokinase that provides for its biological activity; performing in vitro site-directed mutagenesis on the DNA fragment to replace one or more codons for wild-type amino acids by a codon for another amino acid; cloning the mutated DNA fragment in a suitable vector; transforming or transfecting a suitable host cell with the vector; culturing the host cell under conditions suitable for expressing the DNA fragment; purifying the expressed staphylokinase derivative to homogeneity and chemically modifying substituted Cys residues with thiol- directed polyethylene glycol; preferably the DNA fragment is a 453 bp EcoRI- HindIII fragment of the plasmid pMEX602sakB, (pMEX.SakSTAR), the in vitro site- directed mutagenesis is performed by spliced overlap extension polymerase chain reaction and the mutated DNA fragment is expressed in E. coli strain TG1 or WK6. The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising at least one of the staphylokinase derivatives according to the invention together with a suitable excipient, for treatment of arterial thrombosis.
L'invention concerne des techniques d'identification, de production et d'utilisation de dérivés de la staphylokinase, caractérisées par une antigénicité réduite après administration à des patients. Ces dérivés peuvent être administrés en une seule injection d'embol intraveineux. Pour obtenir ces dérivés, on prépare un fragment d'ADN comprenant au moins la partie de la séquence codante de la staphylokinase responsable de son activité biologique; on exécute in vitro la mutagénèse dirigée du fragment d'ADN de manière à remplacer un ou plusieurs codons des acides aminés de type sauvage par un codon d'un autre acide aminé; on clone le fragment d'ADN muté en un vecteur approprié; on transforme ou on transfecte une cellule hôte appropriée avec le vecteur; on cultive la cellule hôte dans des conditions qui permettent l'expression du fragment d'ADN; on purifie le dérivé de staphylokinase exprimé de manière à le rendre homogène et on modifie chimiquement des résidus Cys substitués par un polyéthylène glycol orienté thiol. Le fragment d'ADN est de préférence un fragment EcoRI-HindIII de 453 bp du plasmide pMEX602sakB, (pMEX.SakSTAR). La mutagénèse dirigée in vitro se fait par réaction de chaîne polymérase PCR avec extension par épissage des zones de chevauchement et le fragment d'ADN muté est exprimé dans la souche TG1 ou WK6 d'E. coli. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant au moins l'un des dérivés de la staphylokinase et un excipient qui permet de traiter la thrombose artérielle.
Collen Desire Jose
Fetherstonhaugh & Co.
Tromb-X N.v.
LandOfFree
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