C - Chemistry – Metallurgy – 12 – N
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
N
C12N 15/10 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)
Patent
CA 2239879
The invention provides improved methods of introducing site-directed mutations into circular DNA molecules of interest by means of mutagenic primer pairs. The mutagenic primer pairs are also selected so as to be either completely complementary or partially complementary to each other, wherein the mutation site (or sites) is located within the region of complementarity. A mutagenic primer pair is annealed to opposite strands of a circular DNA molecule containing the DNA sequence to be mutagenized. After annealing, first and second mutagenized DNA strands, each incorporating a member of the mutagenic oligonucleotide primer pair is synthesized by a linear cyclic amplification reaction. After the linear cyclic amplification mediated synthesis step is completed, the reaction mixture is treated with a selection enzyme that digests the parental template strands. After the digesting step, a double- stranded circular DNA intermediate is formed. The double--stranded circular DNA intermediates are transformed in suitable competent host cells and closed circular double-stranded DNA corresponding to the parental template molecules, but containing the desired mutation or mutations of interest, may be conveniently recovered from the transformed cells. The invention also provides kits for site-directed mutagenesis in accordance with methods of the present invention.
L'invention concerne des méthodes améliorées pour introduire des mutations dirigées dans des molécules d'ADN circulaires considérées en utilisant des paires d'amorces mutagènes. Les paires d'armorces mutagènes sont choisies pour être entièrement ou partiellement complémentaires, le ou les sites de mutation étant situés dans la région de complémentarité. La paire d'amorces mutagènes est hybridée avec les brins opposés d'une molécule d'ADN circulaire contenant la séquence d'ADN à modifier par mutagenèse. Après l'hybridation, les premier et second brins d'ADN ayant subi une mutagenèse, comprenant chacun un élément de la paire d'amorces oligonucléotidiques mutagènes sont synthétisés par une réaction d'amplification cyclique linéaire. Après avoir terminé l'étape de synthèse consistant en une amplification cyclique linéaire, le mélange réactionnel est traité avec une enzyme de sélection qui digère les brins matriciels parentaux. Après l'étape de digestion, on forme un ADN intermédiaire circulaire à deux brins. Les intermédiaires d'ADN circulaire à deux brins sont utilisés pour transformer des cellules hôtes appropriées compétentes. On peut, d'une manière avantageuse, récupérer des cellules transformées, l'ADN circulaire fermé à deux brins correspondant aux molécules matricielles parentales, mais contenant la ou les mutations recherchées. L'invention concerne également des nécessaires pour réaliser une mutagenèse dirigée selon la méthode décrite.
Bauer John C.
Braman Jeffrey C.
Geha Raif S.
Wright Dowain A.
Agilent Technologies Inc.
Kirby Eades Gale Baker
Stratagene
The Children's Medical Center Corporation
LandOfFree
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1480228