C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01)
Patent
CA 2332339
An improved method for the simultaneous sequence-specific identification of mRNAs in a mRNA population allows the visualization of nearly every mRNA expressed by a tissue as a distinct band on a gel whose intensity corresponds roughly to the concentration of the mRNA. In general, the method comprises the formation of cDNA using anchor primers to fix a 3-endpoint, producing cloned inserts from the cDNA in a vector containing a bacteriophage-specific promoter for subsequent RNA synthesis, generating linearized fragments of the cloned inserts, preparing cRNA, transcribing cDNA from the cRNA using a set of 5-RT primers, and performing PCR using a 3-PCR primer whose sequence is derived from the vector and a set of 5-PCR primers that is derived from the 5-RT primers used for transcription of cDNA from cRNA. The method can identify changes in expression of mRNA associated with the administration of drugs or with physiological or pathological conditions.
L'invention concerne un procédé amélioré d'identification simultanée, par séquences, de différents ARNm compris dans une population d'ARNm. Ce procédé permet de visualiser presque chaque ARNm exprimé par un tissu sous forme d'une bande distincte sur un gel dont l'intensité correspondant en gros à la concentration d'ARNm. Le procédé consiste en général à produire de l'ADNc par l'intermédiaire d'amorces de fixation permettant de fixer une extrémité 3', à produire des segments d'insertion clonés à partir de l'ADNc dans un vecteur contenant un promoteur spécifique de bactériophage en vue d'une synthèse subséquente d'ARN, à créer des fragments linéarisés de ces segments d'insertion clonés, à préparer de l'ADNc, à transcrire l'ARNc en ADNc au moyen d'une série d'amorces RT-5', et à effectuer une PCR en utilisant une amorce PCR-3' dont la séquence est dérivée du vecteur et une série d'amorces PCR-5' dérivées des amorces RT-5' utilisées pour la transcription de l'ARNc en ADNc. Ce procédé permet l'identification de modifications de l'expression de l'ARNm, associées à l'administration de médicaments ou à des états physiologiques ou pathologiques
Hasel Karl W.
Sutcliffe J. Gregor
Fetherstonhaugh & Co.
The Scripps Research Institute
LandOfFree
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