C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/68 (2006.01)
Patent
CA 2699856
A real-time method of detecting the presence and/or amount of a methylated or unmethylated gene of interest in a DNA- containing sample, comprises the steps of: (a) contacting the DNA- containing sample with a reagent which selectively modifies unmethylated cytosine residues in the DNA to produce detectable modified residues but which does not modify methylated cytosine residues (b) amplifying at least a portion of the methylated or unmethylated gene of interest using at least one primer pair, at least one primer of which is designed to bind only to the sequence of methylated or unmethylated DNA following treatment with the reagent, wherein at least one primer in the primer pair is a primer containing a stem loop structure carrying a donor and an acceptor moiety of a molecular energy transfer pair arranged such that in the absence of amplification, the acceptor moiety quenches fluorescence emitted by the donor moiety upon excitation and during amplification, the stem loop structure is disrupted so as to separate the donor and acceptor moieties sufficiently to produce a detectable fluorescence signal which is detected in real-time to provide an indication of the gene copy number of the methylated or unmethylated gene of interest (c) quantifying the results of the real-time detection against a standard curve for the methylated or unmethylated gene of interest to produce an output of gene copy number. The method may be characterised in that the amplification is considered valid where the cycle threshold value is less than (40). Alternatively the method, which may be carried out in real-time or at end point, is characterised in that the portion of the gene which is amplified is between approximately (50) and 250bp, especially for plasma and serum samples.
L'invention concerne un procédé en temps réel de détection de la présence et/ou de la quantité d'un gène d'intérêt méthylé ou non méthylé dans un échantillon contenant de l'ADN, le procédé comprenant les étapes consistant: (a) à mettre en contact l'échantillon contenant de l'ADN avec un réactif qui modifie sélectivement des résidus de cytosine non méthylés dans l'ADN afin de produire des résidus modifiés détectables mais qui ne modifie pas les résidus de cytosine non méthylés; (b) à amplifier au moins une partie du gène d'intérêt méthylé ou non méthylé à l'aide d'au moins une paire d'amorces, au moins une desdites amorces étant conçue pour se lier uniquement à la séquence d'ADN méthylée ou non méthylée après traitement à l'aide du réactif, au moins une amorce de la paire d'amorces étant une amorce contenant une structure tige-boucle portant un fragment donneur et un fragment accepteur d'une paire de transfert d'énergie moléculaire conçue de sorte qu'en l'absence d'amplification, le fragment accepteur piège la fluorescence émise par le fragment donneur lors de l'excitation et pendant l'amplication, la structure tige- boucle étant lysée de manière à séparer les fragments donneur et accepteur suffisamment pour produire un signal de fluorescence détectable qui est détecté en temps réel afin de fournir une indication du nombre de copies de gène du gène d'intérêt méthylé ou non méthylé; (c) à quantifier les résultats de la détection en temps réel par rapport à une courbe standard pour le gène d'intérêt méthylé ou non méthylé afin de produire une sortie de nombre de copies de gène. Le procédé peut être caractérisé en ce que l'amplification est considérée comme étant valide lorsque la valeur de seuil de cycle est inférieure à 40. Dans une variante, le procédé, qui peut être mis en oeuvre en temps réel ou à la fin de la réaction, est caractérisé en ce que la partie du gène qui est amplifiée est comprise entre approximativement 50 et 250 bp, notamment pour des échantillons de plasma et de sérum.
Bierau Katja
Vlassenbroeck Ilse
Gowling Lafleur Henderson Llp
Mdxhealth Sa
Oncomethylome Sciences Sa
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Profile ID: LFCA-PAI-O-1984125