In vitro recombination method

Details In vitro recombination method In vitro recombination method

C - Chemistry, Metallurgy

12

N

C12N 15/09 (2006.01)

Patent

CA 2618699

The present invention relates, e.g., to in vitro method, using isolated protein reagents, for joining two double stranded (ds) DNA molecules of interest, wherein the distal region of the first DNA molecule and the proximal region of the second DNA molecule share a region of sequence identity, comprising contacting the two DNA molecules in a reaction mixture with (a) a non-processive 5' exonuclease; (b) a single stranded DNA binding protein (SSB) which accelerates nucleic acid annealing; (c) a non strand-displacing DNA polymerase; and (d) a ligase, under conditions effective to join the two DNA molecules to form an intact double stranded DNA molecule, in which a single copy of the region of sequence identity is retained. The method allows the joining of a number of DNA fragments, in a predetermined order and orientation, without the use of restriction enzymes.

L'invention porte par exemple sur une méthode in vitro utilisant des réactifs protéiques isolées pour relier deux molécules d'ADN double brin d'intérêt, la région distale de la première molécule d'ADN et la région proximale de la deuxième molécule d'ADN partageant une région d'identité de séquence. Ladite méthode consiste à mettre en contact les deux molécules d'ADN dans un mélange réactif avec: (a) une exonucléase 5' non processive; (b) une protéine de liaison d'ADN monobrin (SSB) accélérant l'annelage des acides nucléiques; (c) une ADN polymérase ne déplaçant pas les brins; et (d) une ligase, dans des conditions permettant de relier les deux molécules d'ADN pour former une molécule intacte d'ADN double brin dans laquelle est maintenue une seule copie de la région d'identité de séquence. La méthode permet de réunir plusieurs fragments d'ADN dans un ordre et une orientation prédéterminés, sans utiliser d'enzymes de restriction.

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