Inhibitors of memapsin 2 and use thereof

Details Inhibitors of memapsin 2 and use thereof Inhibitors of memapsin 2 and use thereof

C - Chemistry, Metallurgy

07

K

C07K 5/03 (2006.01) A61K 38/04 (2006.01) A61K 38/55 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) C07K 5/02 (2006.01) C12Q 1/37 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01) C07K 14/81 (2006.01) C12N 9/64 (2006.01) C12N 9/99 (2006.01)

Patent

CA 2433446

Methods for the production of purified, catalytically active, recombinant memapsin 2 have been developed. The substrate and subsite specificity of the catalytically active enzyme have been determined by a method which determines the initial hydrolysis rate of the substrate by using MALDI-TOF/MS. Alternatively, the subsite specificity of mepapsin can be determined by probing a library of inhibitors with memapsin 2 and subsequently detecting the bound memapsin 2 with an antibody raised to memapsin 2 and an alkaline phosphatase conjugated secondary antibody. The substrate and subsite specificity information was used to design substrate analogs of the natural memapsin 2 substrate that can inhibit the function of memapsin2. The substrate analogs are based on peptide sequences, shown to be related to the natural peptide substrates for memapsin 2. The substrate analogs contain at least one analog of an amide bond which is not capable of being cleaved by memapsin 2. Processes for the synthesis of substrate analogues including isoteres at the sites of the critical amino acid residues were developed and the more than seventy substrate analogues were synthetized, among which MMI-005, MMI-012, MMI-017, MMI-018, MMI-025, MMI-026, MMI-037, MMI-039, MMI-040, MMI-066, MMI- 070, and MMI-071 have inhibition constants in the range of 1.4-61.4 x 109 M against recombinant pro-memapsin 2. These inhibitors are useful in diagnostics and for the treatment and/or prevention of Alzheimer's disease.

L'invention porte sur des procédés de production de mémapsine 2 de recombinaison purifiée à activité catalytique. Les spécificités du substrat et du sous-site de l'enzyme à activité catalytique ont été déterminées au moyen d'un procédé déterminant le taux initial d'hydrolyse des substrats en utilisant le MALDI-TOF/MS, et en variante, la spécificité du sous-site de la mémapsine peut être déterminée en sondant une bibliothèque d'inhibiteurs avec de la mémapsine 2, puis en détectant la mémapsine 2 liée à un anticorps de la mémapsine 2 et à un anticorps secondaire conjugué à une phosphatase alcaline. L'informations de spécificité du substrat et du sous-site a servi à créer des analogues du substrat de la mémapsine 2 naturelle pouvant inhiber les fonctions de la mémapsine 2. Lesdits analogues du substrat se basent sur des séquences peptidiques qui se sont montrées apparentées aux substrats peptidiques naturels de la mémapsine 2, et qui contiennent au moins un analogue d'une liaison amide non clivable par la mémapsine 2. On a mis au point des procédés de synthèse d'analogues de substrats y compris des isotères des sites des résidus critiques d'acides aminés, et plus de 70 analogues de substrats ont ainsi été synthétisés parmi lesquels les MMI-005, MMI-012, MMI-017, MMI-018, MMI-025, MMI-026, MMI-037, MMI-039, MMI-040, MMI-066, MMI-070, et MMI-071 qui présentent des constantes d'inhibition contre la pro-mémapsine 2 de recombinaison allant de 1,4 à 61,4 x 10?-9¿ M. Ces inhibiteurs peuvent servir pour le diagnostic, le traitement et/ou la prévention de la maladie d'Alzheimer.

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