C - Chemistry – Metallurgy – 12 – Q
Patent
C - Chemistry, Metallurgy
12
Q
C12Q 1/42 (2006.01) C12N 1/19 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) G01N 33/15 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
Patent
CA 2366101
The invention relates to an intact cell assay for direct quantitation of protein tyrosine phosphatase (PTP) activity using the baculovirus expression system. A PTP expressed in transformed host insect cells is processed and localized in their predicted subcellular compartments. Assays are performed on the PTP expressing host cells challenged with a substrate such as, p- nitrophenyl phosphate. This substrate is hydrolysed to p-nitrophenol by expressed phosphatase activity. Emergence of p-nitrophenol is determined spectrophotometrically and is a measure of PTP activity. Further, the assay and transformed host cells of this invention are particularly useful in a screening method for selecting potential inhibitors to PTPs. Basically, transformed host cells are pre-incubated with or without inhibitors and the assay conducted as described. This invention relates to an intact cell assay with a direct readout of PTP activity that is useful in a cell-based screening method for selecting inhibitors of PTPs.
L'invention concerne une mesure de cellules entières permettant une quantification directe de l'activité de la protéine tyrosine phosphatase (PTP), cette mesure utilisant un système d'expression à baculovirus. Une PTP exprimée dans des cellules hôtes d'insectes transformées est traitée puis localisée dans les compartiments sous-cellulaires prévus. Les mesures sont effectuées sur des cellules hôtes qui expriment cette PTP et sont stimulées par un substrat comme le phosphate de p-nitrophényle, ce substrat étant hydrolysé en p-nitrophénol par l'activité de phosphatase exprimée. L'apparition de p-nitrophénol est déterminée par une détection spectrophotométrique et constitue une mesure de l'activité PTP. De plus, la mesure et les cellules hôtes transformées de cette invention sont particulièrement utiles dans un procédé de criblage destiné à sélectionner des inhibiteurs potentiels desdites PTP. Les cellules hôtes transformées sont pré-incubées avec ou sans des inhibiteurs, et la mesure est effectuée comme décrit précédemment. Cette invention concerne enfin une mesure de cellules entières permettant une lecture directe de l'activité PTP, cette mesure pouvant être employée dans une méthode de criblage cellulaire de sélection d'inhibiteurs des PTP.
Cromlish Wanda A.
Kennedy Brian P.
Merck Frosst Canada Inc.
Ogilvy Renault Llp/s.e.n.c.r.l.,s.r.l.
LandOfFree
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